환경 과학의 무균 기술

무균 기술을 사용하는 목적은 생물학적 샘플의 오염을 최소화하기 위해 멸균 작업 환경, 장비 및 시약을 만들고 유지하는 것입니다. 이를 위해 작업 공간과 일부 도구는 70% 에탄올과 희석 표백제와 같은 화학 물질로 소독될 수 있습니다. 연구위원은 실험실 코트, 장갑 및 안전 고글과 같은 개인 보호 장비(PPE)를 착용하는 것도 중요합니다.

미디어 및 시약은 박테리아와 같은 대부분의 미생물을 효과적으로 제거하는 0.22 μm 필터를 사용하는 필터 살균 장치를 사용하여 멸균될 수 있습니다. 또는 많은 시약 및 장비도 고열로 살균할 수 있습니다. 예를 들어, 공구, 유리 제품 및 액체 매체의 미생물은 고온 가압 증기에 노출되어 내용을 살균하는 챔버인 오토클레이브에서 열로 죽을 수 있습니다. 또한, 분젠 버너와 같은 화염원을 사용하여 일부 공구를 열살균할 수 있다.

화염 원천의 사용은 또한 무균 작업 환경을 설정하는 가장 일반적인 방법 중 하나입니다. 화염의 열은 공기 대류를 일으켜 버너 근처에서 공중 오염 물질을 들어 올리는 업드래프트를 생성하고 무균 실험 작업을 수행하는 "멸균 필드"를 만듭니다.

1. 무균 작업 준비

1. 실험실 코트, 라텍스 또는 니트릴 장갑(눈물이나 구멍이 없는), 안전 고글(그림1)을획득하고 적용합니다. 화염을 사용하는 경우 안전을 위해 긴 머리를 다시 묶습니다.
   
   그림 1: PPE: 실험실 코트, 라텍스 장갑 및 안전 고글.
2. 무균 기술의 두 번째 중요한 측면은 실험실에서 사용되는 미디어 / 시약의 적절한 살균 및 저장입니다. 액체 국물매체(예:트립틱 콩 육수)와 한천계미디어(예:R2A)를 적절한 양의 건조염기 분말을 계량하여 준비하여 적절한 양의 이온화물에 첨가한다.
3. 국물 매체의 경우, 낮은 열이 적용된 핫 플레이트에 분말을 용해하고, 100mL 볼륨으로 유리 나사 상단 플라스크에 액체를 분배하거나 10mL 볼륨으로 유리 나사 탑 테스트 튜브에 분배합니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 파우더가 완전히 녹을 때까지 뜨거운 플레이트 교반기에서 아가로즈 배지를 저어줍니다.
4. 용기에 자동 클랩 테이프를 적용하고 제조업체의 지침에 따라 미디어를 자동 복제합니다(예 :121 °C에서 20 분)(그림 2 및 3). 오토클레이브 테이프의 줄무늬 색상은 흰색(자동 복제 전)에서 검은색(포스트 오토클레이브)으로 변경되어야 합니다. 색상 변화는 일반적으로 멸균이 성공했음을 나타내지만, 포자 스트립 키트를 사용하여 멸균 검사를 실시하여 오토클레이브 공정을 확인할 수 있습니다.
   
   그림 2: 재질에 적용중인 오토클레이브 테이프.
   
   그림 3: 자동 복제 테이프의 스트라이프 색상 변경내용은 흰색(자동 복제 전)에서 검은색(포스트 오토클레이브)으로 변경합니다.
5. 액체 국물을 실온으로 식힌 다음 실온에서 보관하거나 4 °C에서 냉장 보관하십시오.
6. 용기를 ~50°C로 설정하여 아가로즈 배지를 식힙니다. 식으면 미디어를 멸균 페트리 접시에 부을 수 있습니다. 매체가 냉각되고 고화되도록 한 다음 제조업체가 지정한 온도에서 저장을 통합합니다.
7. 고온이 중요한 성분을 저하시키면서 자동화할 수 없는 여러 종류의 문화 매체가 있습니다. 이러한 살균은 0.22 μm 필터를 사용하는 진공 여과 시스템을 사용하여 필터 살균이 필요하며 적절한 온도에서 보관해야 합니다.
8. 벤치탑에서 작업을 수행하기 전에 적절한용액(예:500ppm 표백제)을 사용하여 표면을 소독합니다. 이것은 작업 표면에서 문화 및 멸균 매체로 오염 물질을 전송의 위험을 낮춥다.
9. 멸균 필드를 설정하려면 분젠 버너를 켭니다. 금속 접종 루프를 살균하는 데 가장 적합한 화염 유형은 강렬한 푸른 불꽃이며 중간에 관찰된 파란색콘(그림 4)이있습니다.
   
   도 4: 한 페트리 플레이트로부터 박테리아의 이송이 배양된 분리물의 성장을 다른 무접종 페트리 플레이트로 표시하여 한천계 성장 배지를 함유하고 있다.
10. 불꽃의 가장 뜨거운 부분(파란색 원뿔 끝)을 천천히 전달합니다. 루프는 살균을 위해 빨간색 핫으로 바꿔야 합니다.

2. 세균 전달: 페트리 플레이트에서 페트리 플레이트까지

1. 박테리아를 옮기는 한 가지 시나리오는 배양된 분리의 성장을 다른 것으로 표시하는 페트리 플레이트에서, 한천 계 성장 배지를 함유한 멸균 페트리 플레이트이다.
2. 시작하려면 순수한 세균 배양을 포함하는 페트리 플레이트를 약간 열고 뜨거운 살균 된 접종 루프를 천 표면에 부드럽게 누릅니다.
3. 냉각된 접종 루프를 사용하여 플레이트 표면에서 분리된 콜로니 하나를 검색하고 페트리 플레이트를 닫습니다.
4. 배양 매체를 함유한 신선한 페트리 플레이트를 사용하여 뚜껑을 약간 아자르로 사용하여 절연을 위한 줄무늬를 수행합니다.
5. 격리 줄무늬의 각 부분(플레이트당 총 3개)에 대해 사용하기 직전에 염증 루프를 멸균합니다. 또한, 최종 줄무늬 직후루프를 살균하여 벤치 표면의 오염을 방지하고 나중에 사용하거나 접종 루프와 접촉할 수 있는 실험실내 다른 사람들에게 고려된다.
6. 줄무늬 접시를 하룻밤 동안 성장을 위한 인큐베이터에 넣습니다.

3. 세균 전달: 국물 문화에서 페트리 플레이트까지

1. 박테리아를 이송하는 두 번째 시나리오는 일반적으로 탁도에 의해 관찰되는 바와 같이 성장을 나타내는 국물 배양에서 성장 배지를 함유하는 멸균 페트리 플레이트로 나타낸다.
2. 순수한 세균 배양을 포함하는 시험관(또는 플라스크)에서 캡을 제거하고, 화염의 가장 뜨거운 부분을 통해 용기의 개구부를 2-3배 나통과한다. 오염을 방지하기 위해 캡을 벤치탑에 내려 놓지 마십시오.
3. 살균된 접종 루프를 튜브/플라스크로 조심스럽게 낮추고 용기 의 측면에 부드럽게 눌러 국물 배양물에 삽입하기 직전에 식힙니다.
4. 국물 배양(그림5)의루프를 제거하고 즉시 캡을 교체합니다.
   
   그림 5: 국물 문화의 한 루프.
5. 배양 매체를 함유한 신선한 페트리 플레이트를 사용하여 뚜껑을 약간 아자르로 사용하여 절연을 위한 줄무늬를 수행합니다.
6. 줄무늬의 각 부분(플레이트당 총 3개)에 대해 사용하기 직전에 염증 루프를 멸균합니다. 또한, 최종 줄무늬 직후루프를 살균하여 벤치 표면의 오염을 방지하고 나중에 접종 루프를 사용할 수 있는 실험실내 다른 사람들에게 고려된다.
7. 하룻밤 동안 성장을 위한 인큐베이터에 격리를 위해 줄무늬 판을 놓습니다.

4. 세균 전달: 성장이 있는 페트리 플레이트에서 멸균 액체 매체까지

1. 박테리아를 이송하는 세 번째 시나리오는 격리된 배양 줄무늬를 포함하는 페트리 플레이트에서 멸균 액체 성장 배지를 함유한 튜브/플라스크로 분리된 것입니다.
2. 순수한 세균 배양을 포함하는 페트리 플레이트를 약간 열고, 천 표면에 부드럽게 눌러 뜨거운 접종 루프를 냉각시.
3. 냉각된 접종 루프를 사용하여 플레이트 표면에서 분리된 콜로니 하나를 검색하고 페트리 플레이트를 닫습니다.
4. 멸균 액체 성장 배지를 함유한 시험관(또는 플라스크)에서 캡을 제거하고, 화염의 가장 뜨거운 부분을 통해 용기의 개구부를 2~3회 전달한다. 오염을 방지하기 위해 캡을 벤치탑에 내려 놓지마십시오.
5. 추출된 식민지를 액체 국물 배지로 조심스럽게 낮추고 박테리아를 방출하기 위해 루프를 부드럽게 교반합니다. 즉시 캡을 교체합니다.
6. 벤치 표면의 오염을 방지하고 나중에 접종 루프를 사용할 수 있는 실험실의 다른 사람들을 고려하여 접종 루프를 화염 멸균합니다.
7. 플라스크를 하룻밤 동안 성장을 위해 인큐베이터에 넣습니다.
8. 다음 날 인큐베이션에서 플라스크를 제거합니다. 문화를 열거하기 위해 희석 시리즈를 수행합니다.
9. 시리즈에서 희석을 아가로즈 문화 매체에 접시에 접시를 접시를 접시에 접시를 접시.
10. 다음날 플레이트를 제거하고 오염을 관찰하십시오.

5. 세균 전달: 국물 배양에서 멸균 액체 성장 매체에

1. 박테리아를 이송하는 네 번째 시나리오는 멸균 액체 성장 배지를 함유한 튜브/플라스크로 성장을 나타내는 국물 배양에서 이다.
2. 순수한 세균 배양을 포함하는 시험관(또는 플라스크)에서 캡을 제거하고, 불꽃의 가장 뜨거운 부분을 통해 용기의 개구부를 두 번 전달한다. 오염을 방지하기 위해 캡을 벤치탑에 내려 놓지 마십시오.
3. 튜브/플라스크에 접종 루프를 조심스럽게 내리고 용기 의 측면에 부드럽게 눌러 국물 배양에 삽입하기 직전에 식힙니다.
4. 국물 배양물 한 루프를 제거하고 즉시 캡을 교체합니다.
5. 멸균 액체 성장 배지를 함유한 시험관(또는 플라스크)에서 캡을 제거하고, 불꽃의 가장 뜨거운 부분을 통해 용기의 개구부를 두 번전달한다. 오염을 방지하기 위해 캡을 벤치탑에 내려 놓지 마십시오.
6. 추출된 루프를 멸균 액수 액수 배지로 조심스럽게 낮추고 박테리아를 방출하기 위해 루프를 부드럽게 교반합니다. 즉시 캡을 교체합니다.
7. 벤치 표면의 오염을 방지하고 나중에 접종 루프를 사용할 수 있는 실험실내 다른 사람들에게 고려하기 위해 접종루프(도 6)를화염멸균한다.
   
   그림 6: 분젠 버너로 살균되는 동안 빨간색 뜨겁게 변하는 반복 루프.
8. 플라스크를 하룻밤 동안 성장을 위해 인큐베이터에 넣습니다.
9. 다음 날 인큐베이션에서 플라스크를 제거합니다. 문화를 열거하기 위해 희석 시리즈를 수행합니다.
10. 시리즈에서 희석을 아가로즈 문화 매체에 접시에 접시를 접시를 접시에 접시를 접시.
11. 다음날 플레이트를 제거하고 오염을 관찰하십시오.

절차의 결과는 적절한 무균 기술과 가난한 무균 기술을 보여줍니다. 도 7은 아가로즈 플레이트(상단 플레이트: 멸균 매체; 하단 플레이트: 오염된 매체)를 부을 때 불량 한 무균 기술에서 발생할 수있는 오염을 보여줍니다.

그림 7: 아가로즈 플레이트를 부을 때 불량 한 무균 기술에서 발생할 수있는 오염. 상단 플레이트: 멸균 매체; 하단 플레이트: 오염된 미디어.

Bunsen 버너를 사용하는 것 외에도 무균 작업 환경은 라미나르 흐름 후드로 알려진 특수 워크스테이션에서 유지관리될 수 있으며, 이는 지시된 기류와 필터를 사용하여 멸균을 유지할 수 있습니다.

무균 기술의 적절한 사용은 미디어, 시약 및 배양 된 격리와 함께 작업 할 때 현장과 실험실에서 샘플링 할 때 환경 미생물학자에게 매우 중요합니다.  현장에서 가난한 무균 기술은 기술자에서 중요한 환경 샘플로 미생물을 옮기고 미생물을 한 샘플에서 다른 샘플로 교차 오염시킬 수 있습니다. 이러한 사건은 예를 들어, 주어진 생물체에 존재할 수 있는 세균및 곰팡이 인구를 식별하고 비교하고자 하는 미생물 생태학 연구에서 중요합니다. 이러한 샘플의 오염으로 인해 데이터 무결성이 손실될 수 있습니다. 무균 기술은 또한 현장 샘플링에서 유래한 실험실 배양 분리 또는 잘 확립된 미생물 및 세포 배양 저장소에서 유래한 격리에 중요합니다. 오염된 문화를 "정화"하거나 대체하는 노력의 일환으로 실험실에서 요구되는 시간, 인건비 및 재정적 비용, 특히 독특한 환경에서 드문 격리는 일부 격리가 대체할 수 없기 때문에 매우 높고 금지적일 수 있습니다.