Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education Library
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

聚合酶链反应与凝胶电泳检测环境微生物
 

聚合酶链反应与凝胶电泳检测环境微生物

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

聚合酶链反应或 PCR,是基本的生物技术,广泛应用于探测与识别微生物存在于土壤、 水和其他环境样品。

经典,微生物是在实验室使用专门的培养基中培养。然而,许多微生物在自然环境中的是"非可培养"— — 因为他们有代谢活性很低或增长率,或者因为他们有可能在培养皿中无法复制的非常严谨的增长要求。绦虫在微生物间的差异也意味着,当从环境样品微生物培养的时候,他们相对充裕的文化可能不反映其在环境中的实际水平。

聚合酶链反应,可以专门放大甚至少量的 DNA 混合样本中存在,使它得以快速检测和识别特定的兴趣,甚至那些非可培养,在各种复杂的有机体的环境样品中微生物。

这个视频将介绍聚合酶链反应的原理。然后,它将讨论一般协议进行 PCR 的 DNA 分离环境样品检测的有机体的利益存在。最后,将探索基于 PCR 的微生物鉴定的几种应用。

Pcr 技术的基本前提是使用循环的序贯温度变化来实现指数扩增的 DNA,通常称为热循环仪,以自动在不同温度下循环机。从细菌生活在温泉,如研究者或"Taq"获得的 DNA 聚合酶进行 DNA 合成。这些聚合酶的热稳定性,使它们能承受高温在 PCR 过程中使用。

目标序列,称为扩增子,是从使用两个短绵延的核苷酸称为"引"的 DNA 模板扩增。由于互补核酸结合的高度特异性,引物允许非常特定序列的感兴趣的有针对性地放大。通过设计引物,只会放大一个唯一的序列或独特的序列,从有机体的兴趣,PCR 可以用于差异检测该有机物的 DNA 之间复杂的环境样品中的所有基因材料的存在。

每个 PCR 周期分为三个阶段。第一,素有"变性",通常设置为高于 92 ° C,持续约 30 美国变性用于 DNA 分子分成单股,以允许进行扩增反应。

第二阶段,"退火",设置 2 到 3 ° C 以下的两个引物的熔点较低,通常 50 到 65 ° C 之间,和也持续约 30 美国熔点温度是在其中 50%的双链 DNA 分子有分隔成单股的温度和退火步骤可以使引物将绑定到其目标站点中的 DNA 模板。

聚合酶链反应周期的第三阶段是"伸长"或"扩展",当 DNA 聚合酶将绑定到引物-模板工和催化合成的新股。设置在 72 ° C 为最常用的聚合酶链反应聚合酶,Taq,这一阶段的持续时间取决于长度的扩增子,通常 30 s 每 500 碱基。每个循环后扩增的 DNA 再次变性,并作为一个新的模板,导致 PCR 产物的指数增加。

反应完成后,可通过"凝胶"通常由聚合物琼脂糖,该过程称为电泳上大小解决 PCR 产物。在凝胶,施加电场和 DNA 分子的骨干负电荷使他们迁移领域积极年底。一般来说,较大的线性 DNA 分子需要较长时间穿越凝胶基质。

现在,您了解 pcr 技术的工作原理,让我们看看如何反应可以用于识别环境样品中的微生物。

若要开始,计算每个所需的试剂量基于数样品处理,加上额外的 10%,占移液的错误。阳性对照模板-其中包含目标区域-应包括以确保反应工作;以及一个消极控制没有 DNA 模板是包括在内,以排除任何反应组分中的污染。保持 Taq 聚合酶在冰上的和解冻其余的试剂和 DNA 样品在室温下在指定的层流罩,以防止污染。

一旦所有的试剂有解冻,构成试剂"主组合"计算每个试剂的量加入低绑定离心管,最小化到管表面分子由于吸附试剂量的差异。轻轻地涡和离心机在添加之前的每个试剂。一旦主人混合被编写,涡混合,通过离心收集。

标签指定为每个样品,包括控件的一个管 8 管 PCR 地带。取适量的 PCR 主掺入每个管的地带。然后,将每个 DNA 样本添加到各自的管。

盖带安全上带管,并且在与带适配器的迷你离心机短暂离心。然后,将导管放入热循环仪,并运行相应的 PCR 程序根据反应。

应用 pcr 技术正在运行时,准备的 PCR 产物电泳琼脂糖凝胶。称出适量的凝胶可以解决基于他们预期大小的 PCR 产物浓度的琼脂糖粉。琼脂糖加入 125 毫升瓶,然后加适当体积的凝胶运行缓冲区进瓶,基于铸,凝胶的体积和旋流混合。微波在 1 分钟的高功率琼脂溶液。完成后,验证琼脂糖完全溶解由旋转烧瓶,并重复微波 30-s 增量,如有必要。

紧紧地安全上瓶帽和把琼脂糖溶液冷却到 50 ° C 由旋流在流动的冷水下烧瓶。一旦冷却,加入琼脂糖 1 μ L 的溴化乙锭。因为溴化乙锭是潜在的致癌物质,一定要戴护目镜,大褂和溴化乙锭溴化耐手套等个人防护装备。

琼脂溶液倒入电泳凝胶注模成型托盘,确保没有气泡被困在琼脂糖。将所需数量的井用一把梳子放入解决方案。离开这种凝胶在室温为 20 到 30 分钟来巩固。一旦设置了这种凝胶,小心拔出梳子,确保不是来撕毁凝胶过程中。

将凝固的凝胶放入电泳室。LB 缓冲区添加进了舱室,直到凝胶只是淹没。在一块石蜡,吸管"现货"的 DNA 阶梯的 PCR 产物的预期大小适当的范围。从热循环仪检索完成反应的 PCR 管。经短暂离心,收集 PCR 管凝析油和添加的每个样品上石蜡 8 μ L。添加 2 μ L 的 10 x 加载到每个点的 PCR 产物的染料,以便最终浓度的染料是 2 x。

装入了指定的井,在琼脂糖凝胶,小心不要戳通过凝胶样品和梯子。一旦加载完毕,盖上盖子向电泳分庭,并将电极连接到电源。由于 DNA 负电荷,向正极迁移,请确保井一边的接近,到负电极。打开电源,并将它设置为一个电压适当大小的电泳室和正在使用的缓冲系统。设置电泳"运行"。小气泡室两侧向上移动将会观察到是否电泳正确进行。

一旦染料前面已足够先进下凝胶,关闭电源。仔细地运输到凝胶成像仪可视化 electrophoresed 的产品凝胶。具有保护罩,打开紫外线光和可视化在凝胶上的 DNA 条带。分析乐队来看看它是否匹配预期的模式,指示环境样品中感兴趣的物种的存在的位置。

现在,您已看到 PCR 如何进行的让我们看看它应用的各种方式来检测微生物对环境的关注。

以 PCR 为基础的环境微生物检测的用途之一是找出引起疾病的生物,如"大脑吃虫" Naegleria fowleri,单细胞有机体,发现在新鲜水机构,可以攻击人类的中枢神经系统,常常是致命的氯化处理的池。这要么水样中的致命细菌的存在或疑似病人脑脊液可以通过执行使用目标在阿米巴变形虫的基因组中独特的 DNA 序列的引物的 PCR 测试。

另一个应用程序的基于 PCR 的微生物鉴定是来测试作为公共卫生监测和疾病爆发调查的一部分附近食肆,被捕的苍蝇致病性细菌的存在。

在这里,调查人员由首先隔离从体表和消化道的苍蝇,细菌,然后使用物种特异性的培养条件对这些感兴趣的物种丰富寻找致病细菌如沙门氏菌和李斯特菌的存在。后从任何被培养的细菌中提取 DNA,商业上可用的种属特异性检测 PCR 试剂盒用来测试他们的身份。

最后,不同菌株的抗生素耐药致病性细菌如金黄色葡萄球菌、 目前主要的公共卫生问题,可以确定和区分与聚合酶链反应。

在此示例中,研究人员分离和培养金黄色葡萄球菌从临床标本,然后从细菌菌落中提取 DNA 并执行 PCR。这里的扩增反应了"多路复用",意思针对不同的独特地区的细菌基因组的多个引物集被合并成相同的反应。个别底漆套被设计,以便 PCR 产物引起的不是别人,但只有一些菌株的 DNA,为每一株观察了组合,独特的产品带模式。

你刚看了朱庇特的视频基于 PCR 的微生物检测。我们已经看过聚合酶链反应; 背后的原则一种用于对环境微生物; 从中提取 DNA 进行 PCR 协议和最后,几个具体应用这种技术来测试生物的不同类型的环境或临床样品感兴趣。谢谢观赏 !

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter