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Detección de microorganismos ambientales con la reacción en cadena de polimerasa y la electroforesis en Gel de
 

Detección de microorganismos ambientales con la reacción en cadena de polimerasa y la electroforesis en Gel de

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La reacción en cadena de polimerasa, o PCR, es una técnica biológica fundamental que se aplica extensamente para detectar e identificar microorganismos presentes en suelo, agua y otras muestras ambientales.

Clásicamente, los microorganismos son cultivados en laboratorios utilizando medios de cultivo especializados. Sin embargo, muchos microbios en el ambiente natural son "no cultivables" - ya sea porque tienen muy baja actividad metabólica o tasa de crecimiento, o porque tienen requisitos muy estrictos de crecimiento que pueden no ser reproducibles en una placa de cultivo. Las diferencias de culturability entre microbios también significan que, cuando se cultivan microorganismos de una muestra ambiental, su abundancia relativa en la cultura no podría reflejar su nivel actual en el medio ambiente.

El advenimiento de la PCR, que puede amplificar específicamente incluso pequeñas cantidades de ADN presente en una muestra mixta, permite la rápida detección e identificación de microbios específicos de interés, incluso los que son no-cultivables, dentro de la compleja variedad de microorganismos presentes en una muestra ambiental.

Este video presenta los principios de la polimerización en cadena. Luego discutirá un protocolo general para la realización de PCR de DNA aislado de una muestra ambiental con el fin de detectar la presencia de un organismo de interés. Por último, se estudiarán varias aplicaciones de identificación de la polimerización en cadena-basado del microbio.

La premisa básica de PCR debe utilizar repetido ciclos secuenciales de cambios de temperatura para lograr la amplificación exponencial de ADN, generalmente con una máquina conocida como un termociclador ciclo automáticamente a través de las diferentes temperaturas. La síntesis de ADN se lleva a cabo por las enzimas de polimerasa de la DNA que se obtienen de bacterias viven en aguas termales, como "Taq" Thermus aquaticus . Estas polimerasas son estables, lo que les permite soportar las altas temperaturas utilizadas durante la PCR.

La secuencia de destino, conocida como el amplicón, se amplía de la plantilla de ADN mediante dos tramos cortos de nucleótidos conocidas como "cartillas". Debido a la alta especificidad de unión de cadenas complementarias de ácido nucleico, los iniciadores permiten la amplificación específica de secuencias muy específicas de interés. Mediante el diseño de primers que sólo amplificará una secuencia única, o una combinación de secuencias, de un organismo de interés, PCR puede utilizarse para detectar la presencia de ADN de ese organismo entre todos los materiales genéticos presentan en una muestra ambiental complejo diferencialmente.

Cada ciclo PCR se divide en tres fases. El primero, conocido como "desnaturalización", generalmente se encuentra por encima de 92 ° C y dura unos 30 s. desnaturalización se utiliza para romper las moléculas de ADN en solos filamentos, para permitir la reacción de amplificación para proceder.

La segunda fase, "recocido", se encuentra 2 a 3 ° C por debajo de la parte inferior de la temperatura de fusión de los dos iniciadores, generalmente entre 50 a 65 ° C y también dura unos 30 s. temperatura de fusión es la temperatura en que 50% de la DNA double-stranded moléculas se han separado en solos filamentos, y así el paso de recocido permite que los cebadores enlazar a sus sitios de destino en la plantilla de la DNA.

La tercera fase de un ciclo PCR es el "alargamiento" o la "extensión", cuando la ADN polimerasa se une al duplex primer plantilla y cataliza la síntesis de las hebras nuevas. A 72 ° C por la polimerasa PCR más utilizada, Taq, la duración de esta fase depende de la longitud del amplicón, generalmente 30 s por 500 basepairs. Después de cada ciclo, el DNA amplificado es una vez más desnaturalizado y sirve como una plantilla nueva, llevando a un aumento exponencial en la cantidad de productos de la PCR.

Una vez completada la reacción, los productos PCR se pueden resolver por el tamaño de un "gel" generalmente de la agarosa polímero, un proceso conocido como electroforesis. Se aplica un campo eléctrico a través del gel, y las cargas negativas en la columna vertebral de las moléculas de ADN hacer migrar hacia el extremo positivo del campo. En términos generales, moléculas de ADN lineales que son más grandes tomarán más tiempo para viajar a través de la matriz de gel.

Ahora que entiendes cómo funciona la PCR, echemos un vistazo a cómo la reacción puede utilizarse para identificar microorganismos en una muestra ambiental.

Para empezar, calcular el volumen de cada reactivo necesitada basado en el número de muestras a procesar, además de un 10% adicional para tener en cuenta errores de pipeteo. Una plantilla de control positivo, que contiene la región objetivo - debe ser incluida para asegurar que la reacción está trabajando; así como un negativo de control donde no se incluye, para descartar contaminación en cualquiera de los componentes de la reacción ninguna plantilla de la DNA. Mantenga la enzima polimerasa de Taq en hielo y descongelar el resto de los reactivos y las muestras de ADN a temperatura ambiente en una campana de flujo laminar designado para prevenir la contaminación.

Una vez que todos los reactivos han descongelado, constituyen el reactivo "master mix" agregando el volumen calculado de cada reactivo en un tubo de microcentrífuga de baja obligatoria, que reduce al mínimo las discrepancias en las cantidades de reactivo debido a la adsorción de las moléculas de la superficie del tubo. Suavemente el vortex y centrifugar cada reactivo antes de agregar. Cuando el maestro de la mezcla se prepara, vortex para mezclar y recoge por centrifugación.

Etiqueta de una tira de 8 tubos PCR para designar un tubo para cada muestra, incluyendo los controles. Dispense la cantidad adecuada de mezcla principal de PCR en cada tubo de la tira. Luego, añada cada muestra de ADN en el tubo correspondiente.

Coloque la tapa de la tira firmemente en el tubo de la tira y centrifugar brevemente en una mini centrífuga con adaptador de tira. Luego, coloque el tubo en el termociclador y ejecutar la reacción según el programa apropiado de la polimerización en cadena.

Mientras se ejecuta el PCR, preparar un gel de agarosa para electroforesis de los productos PCR. Pesar una cantidad adecuada de agarosa en polvo para un gel con una concentración que puede resolver los productos PCR basados en sus tamaños esperados. Añadir la agarosa en un matraz de 125 mL y añadir el volumen adecuado de funcionamiento gel tampón en el matraz, basándose en el volumen del gel del molde y agite para mezclar. La solución de agarosa en alta potencia durante 1 minuto en el microondas. Cuando termine, verifique que la agarosa se ha disuelto completamente agitando el matraz y repita el microondas en incrementos de 30-s si es necesario.

Firmemente asegure la tapa en el frasco y enfríe la solución de agarosa a 50 ° C agitando el matraz bajo un chorro de agua fría. Una vez enfriado, añadir 1 μL de bromuro de etidio a la agarosa. Porque el bromuro de etidio es potencialmente carcinogénico, asegúrese de usar equipo de protección personal como gafas, una bata y guantes resistentes a bromuro de etidio.

Verter la solución de agarosa en una bandeja de electroforesis gel-casting, asegurándose de que no hay burbujas de aire quedan atrapadas dentro de la agarosa. Coloque un peine con el número necesario de pozos en la solución. Deje el gel a temperatura ambiente durante 20 a 30 min solidificar. Una vez el gel, retire cuidadosamente el peine, procurando no romper el gel en el proceso.

Coloque el gel solidificado en la cámara de electroforesis. Añadir tampón LB en la cámara hasta que el gel esté apenas sumergido. Sobre un trozo de Parafilm, pipetear un "spot" de la escalera de ADN de un margen adecuado para el tamaño esperado de los productos PCR. Recuperar los tubos PCR con las reacciones terminados en el termociclador. Recoge condensados en los tubos PCR por centrifugación breve y añadir 8 μL de cada muestra en el Parafilm. Añadir 2 μL de 10 x tinte de carga en cada punto del producto de PCR, por lo que la concentración final del tinte es 2 x.

Cargar las muestras y la escala en los pozos designados en el gel de agarosa, teniendo cuidado de no empujar a través del gel. Una vez completada la carga, ponga la tapa a la cámara de electroforesis y conectar los electrodos a la fuente de alimentación. Puesto que el ADN está cargado negativamente y migra hacia el electrodo positivo, asegúrese de que los pozos están en el lado más cercano al electrodo negativo. Encienda el suministro de energía y establecer una tensión apropiada para el tamaño de la cámara de electroforesis y el sistema de buffer utilizado. Establecer la electroforesis a "ejecutar". Pequeñas burbujas moviéndose hacia los lados de la cámara será observado si la electroforesis se está procediendo correctamente.

Una vez que el frente de tinte ha avanzado lo suficiente por el gel, apague la fuente de alimentación. Transporte con cuidado el gel a un formador de gel para visualizar los productos electrophoresed. Con un escudo protector, gire a la luz en el UV y visualizar las bandas de ADN en el gel. Analizar la posición de las bandas para ver si coincide con el patrón esperado que indica la presencia de las especies de interés en la muestra ambiental.

Ahora que usted ha visto cómo se realiza la polimerización en cadena, vamos a ver varias formas se aplica para detectar microorganismos de interés en el medio ambiente.

Es un uso de detección microbiana ambiental basada en PCR para identificar los organismos causantes de enfermedades tales como la "ameba come cerebro" Naegleria fowleri, un organismo unicelular encontrado en cuerpos de agua dulce y pozas unchlorinated que pueden atacar el sistema nervioso humano, a menudo fatal. La presencia de este microbio mortal en las muestras ya sea de agua o el líquido cefalorraquídeo de pacientes sospechosos se puede probar mediante la realización de PCR usando las cartillas dirigidas únicas secuencias de ADN en el genoma de la ameba.

Otra aplicación para la identificación microbiológica de polimerización en cadena-basado es probar para la presencia de bacterias patógenas en las moscas capturadas en las cercanías de los establecimientos de alimentos, como parte de investigaciones de salud pública seguimiento y enfermedad brote.

Aquí, los investigadores buscaron la presencia de bacterias patógenas tales como Salmonella y Listeria, primero aislar bacterias de la superficie del cuerpo y el canal digestivo de moscas, y después usando las condiciones de cultivo específicos para enriquecer de estas especies de interés. Después de extraer el ADN de las bacterias que fueron cultivadas, kits PCR de detección específicos disponibles en el mercado fue utilizado para probar su identidad.

Finalmente, diferentes cepas de bacterias patógenas resistentes a los antibióticos como Staphylococcus aureus, que presentan problemas de salud pública importante, pueden identificar y distinguir con PCR.

En este ejemplo, investigadores aislan y cultivan S. aureus de las muestras clínicas, extraen el ADN de las colonias bacterianas y realizaron PCR. Aquí las reacciones de amplificación fueron "multiplexadas", lo que significa que varios conjuntos de cartilla a diferentes regiones del genoma bacteriano únicas fueron combinados en la misma reacción. Cartilla individual sistemas fueron diseñados para que los productos de la PCR el resultado de ADN de sólo algunas cepas, pero no otros, para que conjuntamente, se observaron patrones de banda de producto único para cada cepa.

Sólo ha visto video de Zeus en la detección de microorganismos basados en PCR. Nos hemos mirado los principios detrás de la reacción en cadena de polimerasa; un protocolo para la realización de PCR en la DNA extraída de los microorganismos ambientales; y por último, varias aplicaciones específicas de esta técnica para probar para los organismos de interés en diferentes tipos de muestras clínicas o ambientales. ¡Gracias por ver!

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