Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education Library
Environmental Microbiology

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 

环境样品使用 RT-PCR RNA 分析

Article

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

逆转录聚合酶链反应或 RT-pcr 技术,使 RNA 病毒和在环境中的微生物的基因表达检测。

不同细胞生物体从人类细菌,用作它们的遗传物质 DNA,某些病毒会有由 rna 组成,包括许多致病性病毒如流感、 埃博拉病毒和艾滋病病毒的基因组。虽然某些病毒可以通过观察致病性表型开发时,用来感染细胞在细胞培养中的发现,大多数有没有基于文化的表征方法.RT-pcr 技术可以用于高灵敏度检测为这些病毒在环境中的存在。

同时,基于 DNA 基因组的生物"快车"由"转录"他们到信使或"m"RNA,可以然后被"翻译"成蛋白质在细胞中执行酶或构造函数在它们的 DNA 基因组编码的遗传信息。由于微生物应付和适应变化环境下打开或关闭各种遗传通路,RT-pcr 技术可以用来监测这种改变基因的表达可作为潜在的生态系统评估员。

这个视频会在背后 RT-pcr 技术的原则,概述广义的过程来执行这项技术,和最后,检查一些今天在环境微生物学中应用此方法的方法。

有到此过程的两个关键部分: RNA 提取生物样品,其次是其反向转录成 DNA。

RNA 分离涉及通过添加分解脂类和蛋白质,其次是机械破碎洗涤剂的溶胞样品中的细胞。通常从病毒中提取 RNA,则需要添加的蛋白酶,是消化蛋白质的酶,来分解病毒衣壳-形成病毒粒子的外衣艰难的蛋白质。另一方面,当从细胞生物获得 RNA,裂解可能需要处理 DNA 降解酶或 DNAases,以避免下游结果被迷惑的化学结构相似的 DNA 的存在。

然后可以从裂解物中两种方式之一提纯 RNA。在一个方法中,称为酸胍硫氰酸盐-酚-氯仿提取,裂解与混合有机水溶液的混合物,然后离心分离阶段。蛋白质会分成有机相,成云相间,裂解的细胞碎片和核酸进入水相。然后可以收集上层水相,和 RNA 由加法酒精,比如降低核酸的溶解度在水中的异丙醇沉淀。

在基于列的 rna,裂解是与酒精混合,然后通过带有负电荷的树脂,如二氧化硅凝胶过滤列。裂解制备,带正电的离子缓冲形式"盐桥",允许将绑定到树脂的核酸的负电荷的磷酸骨干。所有其他污染物然后被冲走了。核酸是"洗脱"从列使用低盐缓冲或水。由于单链 RNA 具有较少比双链 DNA 的负电荷,它可以被优先洗脱使用的特定浓度的缓冲区。

一旦分离,RNA 被变成更化学稳定的 DNA。科学家利用一种自然由类似艾滋病毒的逆转录病毒编码的酶。这种酶被称为逆转录酶或"RT"。

RT 综合互补或"c"DNA 的核苷酸称为底漆一小段。这底漆可以具有不同的序列,根据实验的目的。例如,可以设计引物有一个特定的序列,以检测特定基因或生物。一旦合成,可以定期 pcr 扩增这"第一股"的 cDNA。

现在,我们已了解的 RT-pcr 技术背后的原则,让我们看看在 RNA 样本,从环境上执行这种技术的协议。

开始执行程序,找到使用 GPS 坐标或视力的样本集合位置。选择区域得到概况的微生物栖息地内随机点。

若要收集固体样品,推和手螺旋扭曲成地面土壤到预定的深度。螺旋吊起后,可以在螺旋的空心茎内发现土壤。

这种土壤刮直接进入土壤收集袋,袋标有位置、 名称、 日期、 时间的收集和任何其他必要的资料。

转移到实验室土壤和土壤通过 2 毫米筛子用删除砾石和岩石。分析样品的土壤水分含量,可以丰富对土壤微生物活性的水平。要执行此操作,请参阅此集合的视频"测定水分含量的土壤"。

水样采集,选择类似于土壤集合,感兴趣的站点和收集到壁增厚的无菌塑料瓶的水。注意收集的水的体积。参数的试验水立即喜欢温度、 ph 值、 盐度,可以提供有关预期微生物级别样品中的重要信息。然后,将瓶子放在冷却器和转移到实验室。

病毒等微生物是收集和集中从环境样品。

可以从收集到的病毒提取 RNA,使用商业 RNA 提取试剂盒根据制造商的指示旋转柱法。裂解缓冲液,辅以乙醇,首先被混合样品。将相应数量的自旋列放入集合管,然后应用到列矩阵样品。离心机在大约 12,000 x g 1-2 分钟让核酸绑定到列中,并丢弃液体流通过列。

添加到列的洗涤缓冲液和再次离心。将列放入新的无菌 1.5 毫升低附着微量离心管。然后,添加水是免费的核酸酶,是一种酶降解 RNA,为列和离心机为 30 s,以洗脱 RNA。洗脱的 RNA 可以直到使用存储在-80 ° C。

在实验开始之前应以便发现感兴趣,可以作为标记物的特定微生物存在的序列设计适当的引。

拿出 RT 试剂储存在-20 ° C,和解冻冷冻的试剂在冰上 (或在室温)。这些包括核苷酸、 反向转录缓冲区和引物。一旦解冻,保持试剂对冰;核糖核酸酶抑制剂与逆转录酶,应始终保持在冰上。

虽然试剂正在解冻,计算量和反应的组分浓度。一旦融解试剂,轻轻涡和自旋每个管,以确保内容是混合均匀。

在层流罩,以避免污染,将在主的混合将添加到每个 PCR 管组件组装工作。装配时混合在离心管中的,请确保更改吸液管之间每个试剂,防止污染。所有试剂已都添加到离心管后,轻轻地涡和主人降速混合管以确保均匀的混合物。

标记一组 PCR 管,确保使其包含控件。分装主掺入每个管等体积。然后,添加反应特定组件,如 RNA 提取物或水为阴性对照。

一旦添加的所有组件,管置于热循环仪中,设置要运行的反向转录程序。CDNA 然后可以受到 PCR 扩增。此步骤的详细说明,请参阅此集合的视频聚合酶链反应。

聚合酶链反应完成后,PCR 产物的一些可以被分离并可视化在琼脂糖凝胶上。例如,基因特异性引物在这里用于检测存在的一种 RNA 病毒。从 RT-PCR 反应,但不是能从阴性对照,表明存在这种病毒在被测水样品,得到预期大小的乐队。

基于 RNA 的微生物 RT pcr 鉴定可以分析的生态健康、 环境风险和保护生物多样性。

微生物,清理烃和溶剂从被污染的土壤和水的使用表示基础修复替代。了解本机微生物基因的表达,可以突出显示分解污染物在这些条件下的特定微生物途径。RT-pcr 技术经常被用来放大这种环境样品中的 mRNA。

公共卫生措施往往需要快速监视的环境中感染的病毒来源。禽流感,例如,具有高度传染性,可以迅速蔓延到家禽、 牲畜、 和甚至人类。在此特定示例中,研究人员寻找由野生鸟类传播禽流感的威胁。

他们使用一种便携式 RT-pcr 技术安装程序和设备,筛选出野生鸟类,即使在偏远的地区,早期检测感染和防止传输范围。

最后,RT-pcr 技术可以用于表征"生物农药"正在制定目标害虫如玻璃翅的神枪手, Homalodisca 蛹,主机为一种疾病,严重损害了在北美地区的葡萄藤。作为一个代理来感染这种昆虫正在制定新颖的单链 RNA 病毒。使用Homalodisca细胞培养和 RT-pcr 技术确认的病毒载量的组合,这些作者们能够传播病毒用作生物控制剂的浓度高。

你刚看了朱庇特的简介 Analyzing RNA-Based 环境生物 RT-PCR 法检测。你现在应该明白议定书 》,背后的理论如何将技术应用于您的研究,和一些它被用在字段中今天的方法。谢谢观赏 !

Read Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter