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Environmental Microbiology

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量化环境微生物和病毒使用 qPCR

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定量聚合酶链反应或 qPCR 的出现,使得能够定量地确定任何环境样品中的微生物数量。

标准的 PCR,像 qPCR 标识微生物通过检测存在对生物感兴趣的特定的 DNA 序列。这允许不能在实验室中,使它能够测定更广泛的环境生物培养的微生物检测。此外,qPCR 允许 DNA 定量评估的量。但同时,PCR 方法检测 DNA 从所有的有机体,死的还是活的限制只寻找积极成长样品中的微生物的能力。

这个视频会检讨的化学创新 qPCR 区分常规 PCR,解释如何使用 qPCR 定量检测 DNA,表明一个协议来使用 qPCR 来检测一种 RNA 病毒从土壤样品,和最后,显示如何 qPCR 被应用于环境微生物学今天。

QPCR 背后的基本原则是产品的常规 PCR-重复周期的引物退火对模板、 断裂伸长率的 PCR 产物的变性从模板,导致指数扩增的感兴趣,称为扩增子,从池的起始原料的靶序列相同。

QPCR 的创新在荧光化学物质加入的反应,在每个周期直接要由专门补足可视化中"实时"允许 PCR 产物的合成,使它能够量化的原始样品中的模板序列。数量按照阈值周期通常衡量,简写为 Ct,也被称为量化周期或 Cq,即 PCR 循环的荧光产品数量超过本底水平。

量化可以是相对的在一个序列的 Ct值相比另一个标准或控制序列;相对数量等于两个 Ct的差异的幂。或者,如果旁边样品反应中运行一系列已知数量的 DNA,DNA 量荧光值相比标准曲线可以生产,并允许 DNA 样本以绝对量化。

有荧光分子用于 qPCR 分为两种类型。在一个案例中,结合具体的双链 DNA 的荧光染料列入反应。染料只发出荧光,当绑定到 DNA,从而使所用的双链 DNA 产品要能被定量。

在另一种方法,一小段 DNA,称为探针,被设计用来对抗感兴趣的特定目标序列。探针化学附加到一种荧光染料,以及抑制在接近的接近度时染料的荧光信号"淬火"分子。聚合酶,合成 DNA 产品,已有辱人格的 DNA 的活动会导致荧光分子探针,因此从猝灭剂分离染料和允许被检测到的荧光信号从"发布"。

现在,您了解 qPCR 背后的原则,让我们看看一个协议来使用此技术在确定一种 RNA 病毒,感染植物,辣椒轻斑驳病毒,从土壤样品。

在这个演示中,将从根际土壤,土壤大约 7 毫米周围植物根系受到根和他们共生微生物区收集样品。

收集根际土壤,首先仔细从地面,提取感兴趣的植物和打它删除尽可能多的过剩散装尽可能土壤。包在实验室中进一步加工的植物。

后将样品带回实验室,使用无菌铲进收集容器报废所需的土壤。然后,收集病毒从土壤中提取 RNA。

一旦 RNA 从样品收集的转换成互补或通过反转录 cDNA。请参阅朱庇特 SciEd 视频上逆转录 PCR 的此过程的详细信息。

当准备执行 qPCR 时,解冻冷冻的试剂在室温内专用的层流罩,并放置在一次解冻的冰上。包含 DNA 聚合酶试剂组件应始终保持在冰上。

解冻样本基因和 DNA,如一块圆形的称为已克隆入它的感兴趣的扩增子的质粒 DNA 的阳性对照。

之前装配在 96 孔板 qPCR 板反应,准备在纸上,96 单元格表格模板和标签将加载到板反应的每个单元格。包括为每个样品和标准一式三份,以及阳性对照和阴性对照,如无 DNA 反应的反应。

计算所需的反应"主组合",其中包括所有为常量之间反应的试剂的试剂卷。准备所有样品加上控件,和额外的 10%,占移液错误一式三份反应足够主的混合。

一旦融解试剂,组装 1.5 毫升低吸附微量离心管内的混合。要做到这一点,简要涡调匀,收集任何液体在换热管采用小型离心机,每个试剂和吸管试剂到微量离心管。请务必使用新的吸液反应的每个组件。所有试剂后已添加,涡混合和离心。然后,分装适量的主掺入指定井 PCR 板上。

接下来,涡和离心机每管采集与控制 DNA,并对 PCR 板各自入井吸管适量。一旦添加了示例,密封板与密封箔,并使用密封工具完全压扁密封和推动了任何的气泡。仔细地撕下非胶粘标签,从两端的密封。

充分收集到的井底部的反应混合物,将反应板放入离心机与板持有并得到适当的平衡配重盘转子。脉冲-离心机板材可达 1000 转/分,然后让离心机慢慢没有刹车停下来。

将反应板放入 qPCR 机。设置符合制造商的规范,设置熔化温度根据正在使用的对引物聚合酶链反应程序。设置要运行的反应程序。

QPCR 程序完成后,软件将能够使用阳性对照已知的浓度来计算每个反应的基因的数量。然后可以计算的原始样品中的病毒数量。

QPCR 程序完成后,软件将能够使用阳性对照已知的浓度来计算每个反应的基因的数量。

与 qPCR,转入井、 萃取土壤和从反向转录因子的卷的结果可以计算的初始土壤样品中的病毒数量。

现在,你知道 qPCR 如何进行的让我们看看如何使用它来分析不同环境样品。

qPCR 可以用于量化的病毒从许多不同类型的样品中恢复过来。在此应用程序中,两种不同的腺病毒被集中从水样由大量的不同方法。然后从病毒中提取 DNA 并遭受 qPCR,评价浓度方法的相对效率。

另一个应用程序为基于 qPCR 微生物枚举是量化细菌含量食品及农业样品中 — — 在这个示例中,粪便和垃圾鸡农场抽取样本。而不是针对个别物种,科学家们进行 qPCR 使用引物对高度保守的基因存在于所有的细菌,并量化总在样本中发现的细菌群落。

最后,正如前面提到,传统 qPCR 方法的一个缺点是活的和死的微生物无法区分。然而,通过添加一种化学物质被称为丙啶 monoazide 或 PMA,只能输入在哪里它绑定到 DNA 抑制后续酶反应和 pcr 的死细胞,研究人员在这里得以区分死益生菌的发现在受污染的食物和水中常见致病菌株 o157: h7大肠杆菌。

你刚看了量化环境微生物和病毒使用 qPCR 朱庇特的简介。现在,您应该了解 qPCR 是如何工作的如何使用 qPCR 测量量的一种微生物在环境样品和一些应用这种技术。谢谢观赏 !

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