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Environmental Microbiology

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環境微生物やウイルスを使用しての qPCR の定量化
 

環境微生物やウイルスを使用しての qPCR の定量化

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量的なポリメラーゼの連鎖反応、または、qPCR の出現が可能定量的環境試料中のすべての微生物の量を決定します。

標準 PCR のような qPCR は興味の有機体に特定の DNA シーケンスの存在の有無を検出することにより微生物を識別します。環境微生物のはるかに広い範囲を測定することが可能となって、研究室で培養できない微生物の検出が可能になります。また、qPCR は定量的に評価するための DNA の量をことができます。しかし、同時に PCR 方法論はデッドオアア ライブ、サンプル中の微生物を積極的に成長のためだけを検索する機能を制限するすべての有機体から DNA を検出します。

このビデオは通常 PCR の qPCR の区別、qPCR を使用して DNA を定量的に測定する方法を説明する化学の技術革新を確認、qPCR を使用して土壌試料からの RNA ウイルスを検出、および環境微生物学にで qPCR が適用される今日を最後に、示すプロトコルを示します。

QPCR の背後にある基本的な原則は、通常 PCR - テンプレートのプライマーアニー リングのサイクルは、テンプレートから製品の変性と PCR 産物の伸長を繰り返す私アンプリコン、出発物質のプールからとして知られている興味のターゲット シーケンスの指数関数的増幅につながると同じです。

QPCR の革新はで各サイクル専門の thermocyclers で「リアルタイム」で直接可視化することで PCR 製品合成が可能反応に蛍光化学薬品付加は、元のサンプル テンプレート順序量を定量化することが可能。数量閾値サイクルの面では、通常測定、Ct、定量化サイクルまたは Cq、蛍光製品の量がバック グラウンド レベルを超えた、PCR のサイクルである別名を省略します。

別標準または制御シーケンスを 1 つのシーケンスの Ct値を比較、定量化は相対することができます。相対的な量は 2 Ctの差の力に等しいです。または、反応のサンプルと一緒に既知量の DNA のシリーズを実行すると、DNA 量の蛍光値比較標準曲線は作り出すことができるし、量的に表わされる絶対に DNA のサンプルをことができます。

QPCR で使用される蛍光分子の 2 つの広いタイプがあります。1 つの場合、二本鎖 DNA に結合する蛍光染料は反応に含まれます。染料の蛍光を発するは、DNA の二本鎖 DNA 製品測定する量をできるようにするバインドされたときのみ。

他の方法で、プローブとして知られている DNA の短いストレッチは興味の特定のターゲット シーケンスに対して設計されています。プローブは、蛍光色素として近接の場合色素からの蛍光信号を抑制する「癒す」分子に化学的に添付されます。ポリメラーゼの酵素は、DNA の製品を合成するには、蛍光分子プローブは、したがって、クェンチャーから色素を分離し、蛍光シグナルを検出することができますからの「リリース」の原因となる DNA 分解活性があります。

今では qPCR の背後にある原理を理解すると、植物に感染すると、トウガラシマイルドモットル ウイルス、土壌サンプルから RNA ウイルスを識別するためにこの手法を使用するためのプロトコルを見てみましょう。

このデモでは、根圏、土の根との共生微生物によって影響される植物の根の周り約 7 mm のゾーンからサンプルを収集します。

根圏土壌を収集、最初慎重に地面から興味の植物を抽出し余分なバルクとして削除するヒット可能な土壌します。演習でさらに処理工場をパッケージ化します。

研究室に戻るには、サンプルを読み込んだら、コレクションの容器に必要な土壌をスクラップに滅菌スパチュラを使用します。土壌からウイルスを収集し、RNA を抽出します。

サンプルから RNA を収集した後は、相補的にまたは逆のトランスクリプションによる cDNA を変換します。ゼウス SciEd 逆転写 PCR この手順の詳細についてのビデオを参照してください。

QPCR を実行する準備ができたら、専用の層流フードの内部部屋の温度で冷凍試薬を解凍し、一度融解したもの氷の場所します。DNA のポリメラーゼの酵素を含む試薬コンポーネントは、氷の上常に保管してください。

サンプル cDNA と肯定的な制御の興味それにクローンの私アンプリコンを持つプラスミドとして知られている DNA の円形の部分などの DNA を解凍します。

QPCR 96 ウェル プレートで反応を組み立てる前に紙の上 96 セルのテーブル テンプレートを準備し、プレートに読み込まれる反応を各セルにラベルを付けます。肯定的な制御のない DNA 反応などの否定的な制御だけでなく、各サンプルと 3 通、標準の反応があります。

反応の間で一定している試薬のすべてが含まれます「マスター ミックス」の反応に必要な試薬のボリュームを計算します。すべてのサンプルに加えて、コントロール、およびピペット誤差を考慮する、さらに 10% の帳票の反応を十分なマスター ミックスを準備します。

試薬は、解凍後、1.5 mL 低吸着および microfuge の管のマスター ミックスを組み立てます。これを行うに、簡潔に渦を徹底的にミックス、小型遠心分離機を使用して管の側面の任意の液体を収集各試薬および microfuge の管にピペットの試薬。必ず反応コンポーネントごとに新しいピペット チップを使用してください。後すべての試薬が追加されました、ミックスして遠心分離機の渦。その後、PCR プレートに指定されたウェルにマスター ミックスの適切な量の約数。

次に、渦と遠心分離機サンプルとコントロール DNA、各チューブ、PCR プレートの各ウェルに適切な量をピペットします。サンプルを追加すると、プレートにシール箔シールし、シールのツールを使用して完全にシールを平らにし、空気の泡を押し出します。シールの端から非粘着タブを慎重にはがします。

井戸の底に完全に反応混合物を収集するには、プレート ホルダーと遠心分離機に反応プレートを置き、カウンターウェイトのプレートが付いている回転子のバランスをとる。パルス遠心分離機 1,000 rpm までプレートは、遠心ブレーキなしストップに来てゆっくりしてみましょう。

QPCR マシンにリアクション プレートを配置します。使用されているプライマーによると溶融温度を設定、製造元の仕様に従って PCR プログラムを設定します。反応プログラムを実行するを設定します。

QPCR プログラムが完了すると、ソフトウェアは各反応の cDNA の数量を計算する肯定的な制御の既知濃度を使用することになります。元のサンプルでウイルスの量が計算できます。

QPCR プログラムが完了すると、ソフトウェアは各反応の cDNA の数量を計算する肯定的な制御の既知濃度を使用することになります。

QPCR、井戸、土壌からの抽出および逆のトランスクリプションからファクターに転送量の結果と初期の土壌試料中のウイルスの数を計算できます。

今、あなたは、qPCR の実行方法を知って、それを使用して異なる環境試料を分析する方法を見てみましょう。

qPCR を使用して、サンプルの多くの異なる種類から回復したウイルスの量を定量化できます。このアプリケーションでアデノ ウィルスの 2 種類は数多くの異なる方法による水試料から集中していた。DNA はウイルスから抽出し、濃度の方法の相対的な効率を評価する qPCR を受けます。

QPCR による生菌の別のアプリケーションは、食品と農業のサンプル - この例では、糞便細菌の含量を定量化し、養鶏場からサンプルのくずです。個々 の種をターゲットではなく科学者は qPCR のすべての細菌の非常に節約された遺伝子に対するプライマーを使用してを実行し、サンプルの合計細菌群集を定量化します。

最後に、前述したように、従来の qPCR の方法論の欠点の 1 つはライブとデッドの微生物が識別することはできません。ただし、propidium monoazide、または PCR などその後の酵素反応を阻害する DNA に結合する死んだ細胞をのみ入力できます、PMA と呼ばれる化学物質を追加することによって研究者ここでされたエシェリヒア属大腸菌o157: h7、汚染された食物や水は、一般的な病原性株のライブとデッドの文化の間で区別することができます。

環境微生物と qPCR を使用してウイルスを定量化するゼウスの導入を見てきただけ。今、qPCR のしくみ、qPCR を使用して環境のサンプル、およびこの手法のいくつかのアプリケーションで微生物の量を測定する方法を理解する必要があります。見てくれてありがとう!

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