Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Analytical Chemistry

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

עקומות כיול

Overview

מקור: המעבדה של ד"ר .B ג'יל וטון - אוניברסיטת וירג'יניה

עקומות כיול משמשות כדי להבין את התגובה האינסטרומנטלית לאנליטה ולחזות את הריכוז במדגם לא ידוע. בדרך כלל, קבוצה של דגימות סטנדרטיות נעשות בריכוזים שונים עם טווח הכולל את הלא ידוע של עניין ואת התגובה האינסטרומנטלית בכל ריכוז נרשם. לקבלת דיוק רב יותר ולהבנת השגיאה, ניתן לחזור על התגובה בכל ריכוז כך שיושג סרגל שגיאות. הנתונים מתאימים לאחר מכן לפונקציה כך שניתן לחזות ריכוזים לא ידועים. בדרך כלל התגובה היא ליניארית, עם זאת, ניתן לבצע עקומה עם פונקציות אחרות כל עוד הפונקציה ידועה. ניתן להשתמש בעקומת הכיול כדי לחשב את מגבלת הזיהוי והגבלה של כמות.

בעת יצירת פתרונות לעקומת כיול, ניתן ליצור כל פתרון בנפרד. עם זאת, זה יכול לקחת הרבה חומר מתחיל להיות זמן רב. שיטה נוספת ליצירת ריכוזים רבים ושונים של פתרון היא להשתמש בדילול טורי. עם דילול סדרתי, מדגם מרוכז מדולל כלפי מטה באופן צעד כדי להפוך את הריכוזים הנמוכים יותר. המדגם הבא עשוי מהמדלל הקודם, וגורם הדילול נשמר לעתים קרובות קבוע. היתרון הוא שיש צורך בפתרון ראשוני אחד בלבד. החיסרון הוא שכל השגיאות בעשיית פתרונות – צנרת, התקהלות וכו' – מופצים ככל שמתקבלים פתרונות נוספים. לכן, יש לנקוט זהירות בעת ביצוע הפתרון הראשוני.

Principles

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ניתן להשתמש בעקומות כיול כדי לחזות את הריכוז של מדגם לא ידוע. כדי להיות מדויק לחלוטין, הדגימות הסטנדרטיות צריכות להיות מופעלות באותה מטריצה כמו המדגם הלא ידוע. מטריצת מדגם היא מרכיבי המדגם מלבד ניתוח העניין, כולל הממס וכל המלחים, החלבונים, יונים מתכתיים וכו 'שעשויים להיות נוכחים במדגם. בפועל, הפעלת דגימות כיול באותה מטריצה כמו הלא נודע היא לפעמים קשה, כמו מדגם לא ידוע עשוי להיות מדגם ביולוגי או סביבתי מורכב. לכן, עקומות כיול רבות נעשות במטריצה מדגם הקרובה לדגימה האמיתית, כגון נוזל עמוד השדרה המוחי המלאכותי או שתן מלאכותי, אך עשויים שלא להיות מדויקים. טווח הריכוזים של עקומת הכיול צריך סוגריים מרובעים כי במדגם לא ידוע צפוי. באופן אידיאלי כמה ריכוזים מעל ומתחת לדגימת הריכוז הצפוי נמדדים.

עקומות כיול רבות הן ליניאריות ויכולות להתאים למשוואה הבסיסית y=mx+b, כאשר m הוא השיפוע ו- b הוא יירוט ה- y. עם זאת, לא כל העקומות הן ליניאריות ולפעמים כדי לקבל קו, קבוצה אחת או שתיהן של צירים תהיה בקנה מידה לוגריתמי. רגרסיה ליניארית מבוצעת בדרך כלל באמצעות תוכנת מחשב והשיטה הנפוצה ביותר היא להשתמש בהתאמה בריבועים לפחות. עם ניתוח רגרסיה ליניארית, ניתן ערך R2, הנקרא מקדם הנחישות. עבור רגרסיה יחידה פשוטה, R2 הוא הריבוע של מקדם המתאם (r) ומספק מידע אודות המרחק של ערכי ה- y מהקו החזוי. לקו מושלם יהיה ערך R2 של 1, ורוב ערכי R2 עבור עקומות כיול הם מעל 0.95. כאשר עקומת הכיול היא ליניארית, השיפוע הוא מדד של רגישות: עד כמה האות משתנה לשינוי בריכוז. קו תלול יותר עם שיפוע גדול יותר מציין מדידה רגישה יותר. עקומת כיול יכולה גם לסייע בהגדרת הטווח הליניארי, טווח הריכוזים שהמכשיר מעניק תגובה ליניארית. מחוץ לטווח זה, התגובה עשויה להתחדד עקב שיקולים אינסטרומנטליים, ולא ניתן להשתמש במשוואה מהכיול. זה ידוע כגבול הליניאריות.

מגבלת הזיהוי היא הכמות הנמוכה ביותר שניתן לקבוע סטטיסטית מהרעש. בדרך כלל זה מוגדר כאות כי הוא 3 פעמים את הרעש. ניתן לחשב את מגבלת הזיהוי מהשיפוע של עקומת הכיול והיא מוגדרת בדרך כלל כ- LOD = 3 * S.D./m, כאשר S.D. היא סטיית התקן של הרעש. הרעש נמדד על ידי לקיחת סטיית התקן של מדידות מרובות. לחלופין, במעקב אחד, ניתן להעריך רעש כסטיית התקן של קו הבסיס. מגבלת הכמות היא הכמות שניתן להבדיל בין דגימות ומוגדרת בדרך כלל כ-10 פעמים מהרעש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. קביעת התקנים: דילול סדרתי

  1. הפוך פתרון מלאי מרוכז של התקן. בדרך כלל, המתחם נשקל במדויק ולאחר מכן מועבר כמותית לתוך בקבוק נפחי. מוסיפים קצת ממס, מערבבים כך המדגם מתמוסס, ולאחר מכן למלא לקו עם הממס הנכון.
  2. בצע דילול טורי. קח עוד בקבוק נפחי ו pipette את כמות התקן הדרושה לדילול, ולאחר מכן למלא לקו עם ממס ומערבבים. דילול של פי עשרה נעשה בדרך כלל, כך עבור בקבוקון נפחי 10 מ"ל, להוסיף 1 מ"ל של הדילול הקודם.
  3. המשך לפי הצורך עבור דילול נוסף, pipetting מן הפתרון הקודם כדי לדלל אותו כדי להפוך את המדגם הבא. עבור עקומת כיול טובה, יש צורך בלפחות 5 ריכוזים.

2. הפעל את הדגימות עבור עקומת הכיול והלא ידוע

  1. הפעל את הדגימות עם ספקטרופוטומטר UV-Vis כדי לקבוע את התגובה האינסטרומנטלית הדרושה לעקומת הכיול.
  2. קח את הקריאה עם המדגם הראשון. מומלץ להפעיל את הדגימות בסדר אקראי(כלומר לא מהגבוה ביותר לנמוך ביותר או מנמוך לגבוה ביותר) במקרה שיש שגיאות שיטתיות. על מנת לקבל הערכה של רעש, חזור על הקריאה על כל מדגם נתון 3-5x.
  3. הפעל את הדגימות הסטנדרטיות הנוספות, חוזר על המדידות עבור כל מדגם כדי לקבל הערכה של רעש. הקלט את הנתונים כדי ליצור התוויה מאוחר יותר.
  4. הפעל את הדגימות הלא ידועות. השתמש בתנאים דומים ככל האפשר להפעלת התקנים. לכן, מטריצת המדגם או המאגר צריך להיות זהה, ה- pH צריך להיות זהה, והריכוז צריך להיות בטווח של תקנים לרוץ.

3. ביצוע עקומת הכיול

  1. הקלט את הנתונים בגיליון אלקטרוני והשתמש בתוכנית מחשב כדי להתוות את הנתונים לעומת הריכוז. אם נלקחו לפחות מדידות משולשות עבור כל נקודה, ניתן התוויית קווי שגיאה של סטיית התקן של מדידות אלה כדי להעריך את השגיאה של כל נקודה. עבור עקומות מסוימות, ייתכן שיהיה צורך להתוות את הנתונים עם ציר כיומן רישום כדי לקבל קו. המשוואה השולטת בעקומת הכיול ידועה בדרך כלל מראש, כך שנעשה שימוש ביומן רישום כאשר יש יומן רישום במשוואה.
  2. בדוק את עקומת הכיול. זה נראה ליניארי? האם יש לו חלק שנראה לא ליניארי(כלומר הגיע לגבול התגובה האינסטרומנטלית)? כדי לבדוק, התאם את כל הנתונים לרגרסיה ליניארית באמצעות התוכנה. אם מקדם הקביעה (R2) אינו גבוה, הסר חלק מהנקודות בתחילת העקומה או בסיום שאינן מתאימות לקו ומבצע שוב את הרגרסיה הליניארית. זה לא מקובל להסיר נקודות באמצע רק בגלל שיש להם שורת שגיאה גדולה. מניתוח זה, החלט איזה חלק של העקומה הוא ליניארי.
  3. הפלט של הליניארי צריך להיות משוואה של התבנית y = mx+b, כאשר m הוא השיפוע ו- b הוא יירוט y. היחידות עבור השיפוע הן יחידת/ריכוז ציר ה-y, בדוגמה זו (איור 1) ספיגה/מיקרומטר. היחידות ליירוט y הן יחידות ציר y. מקדם נחישות (R2) מתקבל. גבוה יותר R2 טוב יותר את ההתאמה; התאמה מושלמת נותנת R2 של 1. ייתכן שהתוכנית תוכל גם לתת הערכה של השגיאה בשיפוע וביירוט.

4. תוצאות: עקומת כיול של ספיגה של צבע כחול #1

  1. עקומת הכיול לספיגה של #1 צבע כחול (ב- 631 ננומטר) מוצגת להלן (איור 1). התגובה היא ליניארית מ 0 עד 10 מיקרומטר. מעל ריכוז זה האות מתחיל להתיישר כי התגובה היא מחוץ לטווח הליניארי של ספקטרופוטומטר UV-Vis.
  2. חשב את LOD. מהשיפוע של עקומת הכיול, LOD הוא 3 * S.D. (רעש)/מ '. עבור עקומת כיול זו, הרעש הושג על ידי לקיחת סטיית תקן של מדידות חוזרות ונשנות והיה 0.021. LOD יהיה 3 * 0.021/.109 = 0.58 מיקרומטר.
  3. חשב את LOQ. LOQ הוא 10 * S.D.(רעש)/ מ '. עבור עקומת כיול זו, LOQ הוא 10* 0.021/.109 =1.93 מיקרומטר.
  4. חשב את הריכוז של הלא נודע. השתמש במשוואת הקו כדי לחשב את הריכוז של המדגם הלא ידוע. עקומת הכיול תקפה רק אם הלא נודע נופל לטווח הליניארי של הדגימות הסטנדרטיות. אם הקריאות גבוהות מדי, ייתכן שיהיה צורך בדילול. בדוגמה זו, משקה הספורט הלא ידוע היה מדולל 1:1. הספיגה הייתה 0.243 וזה התאים לריכוז של 2.02 מיקרומטר. לכן הריכוז הסופי של צבע כחול #1 במשקה הספורט היה 4.04 מיקרומטר.

Figure 1
איור 1. עקומות כיול לספיגת UV-Vis של צבע כחול. משמאל: הספיגה נמדדה בריכוזים שונים של צבע כחול #1. התגובות ברמה את לאחר 10 μM, כאשר הספיגה היא מעל 1. קווי השגיאה הם ממדידות חוזרות ונשנות של אותה דגימה והם סטיות תקן. מימין: החלק הליניארי של עקומת הכיול מתאים לקו, y=0.109*x + 0.0286. הנתונים הלא ידועים מוצגים בשחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

עקומות כיול משמשות להבנת התגובה האינסטרומנטלית לאנליטה, ולחזות את ריכוז הניתוח במדגם.

עקומת כיול נוצרת על ידי הכנת קבוצה תחילה של פתרונות סטנדרטיים עם ריכוזים ידועים של הניתוח. תגובת המכשיר נמדדת עבור כל אחד מהם, ומתוותת לעומת ריכוז הפתרון הסטנדרטי. החלק הליניארי של חלקה זו יכול לשמש לאחר מכן כדי לחזות את הריכוז של מדגם של האנליטה, על ידי מתאם תגובתו לריכוז.

וידאו זה יציג עקומות כיול ושימוש בהם, על ידי הדגמת הכנת סט של סטנדרטים, ואחריו ניתוח של מדגם עם ריכוז לא ידוע.

מערכת פתרונות סטנדרטיים משמשת להכנת עקומת הכיול. פתרונות אלה מורכבים ממגוון ריכוזים המקיפים את הריכוז המשוער של הניתוח.

פתרונות סטנדרטיים מוכנים לעתים קרובות עם דילול טורי. דילול טורי מבוצע על ידי הכנת פתרון מלאי של הניתוח. פתרון המלאי מדולל לאחר מכן על ידי כמות ידועה, לעתים קרובות סדר גודל אחד. הפתרון החדש מדולל אז באותו אופן, וכן הלאה. התוצאה היא סדרה של פתרונות עם ריכוזים הנעים על פני מספר סדרי גודל.

עקומת הכיול היא חלקה של אות אינסטרומנטלי לעומת ריכוז. התוויית הסטנדרטים צריכה להיות ליניארית, ויכולה להתאים למשוואה y=mx+b. יש להשליך את החלקים הלא ליניאריים של העלילה, מכיוון שטווחי ריכוז אלה הם מחוץ לגבול הליניאריות.

לאחר מכן ניתן להשתמש במשוואה של קו ההתאמה הטובה ביותר כדי לקבוע את ריכוז המדגם, באמצעות אות המכשיר כדי לתאם לריכוז. יש לדלל דוגמאות עם מדידות הנמצאות מחוץ לטווח הליניארי של העלילה, כדי להיות בטווח הליניארי.

ניתן לחשב את מגבלת הזיהוי של המכשיר, או את המדידה הנמוכה ביותר שניתן לקבוע סטטיסטית על פני הרעש, גם מעקומת הכיול. מדגם ריק נמדד מספר פעמים. מגבלת הזיהוי מוגדרת בדרך כלל כאות הריק הממוצע בתוספת פי 3 מסטיית התקן שלו.

לבסוף, ניתן לחשב גם את מגבלת הכימות. מגבלת הכימות היא הכמות הנמוכה ביותר של ניתוח שניתן לכמת במדויק. זה מחושב כ-10 סטיות תקן מעל האות הריק.

כעת, לאחר שלמדתם את היסודות של עקומת כיול, בואו נראה כיצד להכין ולהשתמש בו במעבדה.

ראשית, להכין פתרון מלאי מרוכז של התקן. שוקלים במדויק את הסטנדרט, ומעבירים אותו לבקבוק נפחי. מוסיפים כמות קטנה של ממס, ומערבבים כך שהדגימה תתמוסס. לאחר מכן, למלא את הקו עם ממס. חשוב להשתמש באותו ממס כמו המדגם.

כדי להכין את הסטנדרטים, pipette את הכמות הנדרשת בקבוק נפחי. לאחר מכן למלא את הבקבוק לקו עם ממס, ומערבבים.

המשך לעשות את הסטנדרטים על ידי צנרת מפתרון המלאי ודילול. עבור עקומת כיול טובה, יש צורך בלפחות 5 ריכוזים.

עכשיו, להפעיל דגימות עם המכשיר האנליטי, במקרה זה ספקטרופוטומטר UV-Vis, על מנת לקבוע את התגובה האינסטרומנטלית הדרושה לעקומת הכיול.

קח את המדידה של התקן הראשון. הפעל את הסטנדרטים בסדר אקראי, במקרה שיש שגיאות שיטתיות. מדוד כל תקן 3-5x כדי לקבל הערכה של רעש.

מדוד את שאר הסטנדרטים, חוזר על המדידות עבור כל אחד מהם. הקלט את כל הנתונים.

לבסוף, הפעל את המדגם. השתמש באותם מטריצות מדגם ותנאי מדידה ששימשו עבור התקנים. ודא כי המדגם נמצא בטווח של הסטנדרטים ואת הגבול של המכשיר.

כדי לבנות את עקומת הכיול, השתמש בתוכנית מחשב כדי להתוות את הנתונים כאות לעומת ריכוז. השתמש בסטיית התקן של המדידות החוזרות עבור כל נקודת נתונים כדי ליצור קווי שגיאה.

הסר חלקים מהעיקול שאינם ליניאריים ולאחר מכן בצע רגרסיה ליניארית וקבע את קו ההתאמה הטובה ביותר. הפלט צריך להיות משוואה בטופס y = m x + b. ערך R2ליד 1 מציין התאמה טובה.

זוהי עקומת הכיול עבור צבע כחול #1, נמדד ב 631 ננומטר. התגובה היא ליניארית בין 0 ל 15 מ"ר.

חשב את ריכוז המדגם באמצעות המשוואה של קו ההתאמה הטובה ביותר. הספיגה של המדגם הייתה 0.141, והתאימה לריכוז של 6.02 מ"מ.

כעת, לאחר שראיתם כיצד ניתן להשתמש בעקומת כיול עם ספקטרופוטומטר UV-Vis, בואו נסתכל על כמה יישומים שימושיים אחרים.

עקומות כיול משמשות לעתים קרובות עם יישומי אלקטרוכימיה, כמו אות האלקטרודה חייב להיות מכויל לריכוז של יונים בפתרון. בדוגמה זו, נתונים נאספו עבור אלקטרודה סלקטיבית יוני עבור פלואוריד.

יש להתוות את נתוני הריכוז בסולם יומן הרישום כדי להשיג קו. עקומת כיול זו יכולה לשמש למדידת הריכוז של פלואוריד בתמיסה, כגון משחת שיניים או מי שתייה.

כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים היא טכניקת הפרדה וניתוח המשמשת רבות בכימיה אנליטית. HPLC מפריד מרכיבים של תערובת בהתבסס על הזמן הנדרש עבור המולקולות לנסוע אורך עמודת הכרומטוגרפיה. הפעם משתנה בהתאם למגוון תכונות כימיות של המולקולות.

ההבחנה של המולקולות נמדדת באמצעות גלאי, וכתוצאה מכך כרומטוגרמה. אזור השיא יכול להיות מתואם לריכוז באמצעות עקומת כיול פשוטה של מגוון פתרונות סטנדרטיים, כמו בדוגמה זו של מרכיבי סודה פופולריים.

במקרים מסוימים, כאשר מטריצת הפתרון מפריעה למדידה של solute, עקומת כיול קלאסית יכולה להיות לא מדויקת. במקרים אלה, מעקומת כיול שונה מוכנה. עבור זאת, מגוון של אמצעי אחסון סטנדרטיים של פתרונות נוסף לדגימה. האות לריכוז נוצר, כאשר יירוט x שווה לריכוז המקורי של פתרון המדגם. לקבלת פרטים נוספים על טכניקה זו, אנא צפה בסרטון החינוך המדעי JoVE, "שיטת התוספת הסטנדרטית".

הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לעקומת הכיול. כעת עליך להבין היכן נעשה שימוש בעקומת הכיול, כיצד ליצור אותה וכיצד להשתמש בה כדי לחשב ריכוזים של דגימות.

כמו תמיד, תודה שצפית!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Applications and Summary

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עקומות כיול משמשות בתחומים רבים של כימיה אנליטית, ביוכימיה וכימיה פרמצבטית. זה נפוץ להשתמש בהם עם ספקטרוסקופיה, כרומטוגרפיה, ומדידות אלקטרוכימיה. עקומת כיול יכולה לשמש להבנת הריכוז של מזהם סביבתי בדגימת קרקע. זה יכול לשמש לקבוע את הריכוז של נוירוטרנסמיטר במדגם של נוזל המוח, ויטמין בדגימות תרופות, או קפאין במזון. לפיכך, עקומות כיול שימושיות ביישומי מדעי הסביבה, הביולוגית, התרופות והמזון. החלק החשוב ביותר ביצירת עקומת כיול הוא ליצור דגימות סטנדרטיות מדויקות הנמצאות במטריצה הקרובה לתערובת המדגם.

דוגמה לעקומת כיול אלקטרוכימיה מוצגת להלן (איור 2). הנתונים נאספו עם אלקטרודה סלקטיבית יוני לפלואוריד. נתונים אלקטרוכימיים לעקוב אחר משוואת Nernst E = E0 + 2.03 * R * T / (nF) * יומן C. לכן, יש להתוות את נתוני הריכוז (ציר x) בסולם יומן רישום כדי להשיג קו. עקומת כיול זו יכולה לשמש למדידת הריכוז של פלואוריד במשחת שיניים או במי שתייה.

Figure 2
איור 2. עקומת כיול לאלקטרודה סלקטיבית ינית. התגובה של אלקטרודה סלקטיבית פלואוריד (ב- mV) לריכוזים שונים של פלואוריד הוא שרטט. המשוואה הצפויה עבור תגובת האלקטרודה היא y (ב- mV)=-59.2* log x+b ב- 25 °C (70 °F). המשוואה בפועל היא y=-57.4*log x +56.38. הערך R2 הוא 0.998. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Transcript

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter