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Analytical Chemistry

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Overview

출처: 박사의 실험실.B 질 벤턴 - 버지니아 대학

교정 곡선은 알 수 없는 샘플에서 측정응답을 이해하고 농도를 예측하는 데 사용됩니다. 일반적으로, 표준 샘플 세트는 미지의 관심과 각 농도에서의 기악 반응을 포함하는 범위이상의 다양한 농도에서 이루어진다. 보다 정확성을 높이고 오류를 이해하기 위해 각 농도의 응답을 반복하여 오류 표시줄을 얻을 수 있습니다. 그런 다음 데이터는 함수에 적합하여 알 수 없는 농도를 예측할 수 있습니다. 일반적으로 응답은 선형이지만 함수가 알려진 한 다른 함수로 곡선을 만들 수 있습니다. 교정 곡선을 사용하여 검출 제한 및 수량 제한을 계산할 수 있습니다.

교정 곡선에 대한 솔루션을 만들 때 각 솔루션을 별도로 만들 수 있습니다. 그러나, 그 시작 재료를 많이 걸릴 수 있습니다 및 시간이 많이 소요 될 수 있습니다. 솔루션의 많은 다른 농도를 만들기위한 또 다른 방법은 직렬 희석을 사용하는 것입니다. 직렬 희석을 통해 농축 된 샘플은 단계적으로 희석되어 농도가 낮아집니다. 다음 샘플은 이전 희석으로 만들어지며 희석 계수는 종종 일정하게 유지됩니다. 장점은 하나의 초기 솔루션만 필요하다는 것입니다. 단점은 솔루션 제작,파이펫 팅, 매스 등 솔루션 제작의 오류는 더 많은 솔루션이 만들어짐에 따라 전파된다는 것입니다. 따라서 초기 솔루션을 만들 때주의를 기울여야합니다.

Principles

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교정 곡선을 사용하여 알 수 없는 샘플의 농도를 예측할 수 있습니다. 완전히 정확하려면 표준 샘플을 알 수 없는 샘플과 동일한 행렬에서 실행해야 합니다. 샘플 매트릭스는 시료에 존재할 수 있는 용매 및 모든 염, 단백질, 금속 이온 등을 포함하는 관심 있는 분석물 이외의 샘플의 성분이다. 실제로, 알 수 없는 샘플이 복잡한 생물학적 또는 환경 샘플에서 일 수 있기 때문에, 알 수 없는 것과 동일한 매트릭스에서 교정 샘플을 실행하는 것은 때때로 어렵습니다. 따라서, 많은 교정 곡선은 인공 뇌척수액 또는 인공 소변과 같은 실제 샘플을 밀접하게 근사화하는 샘플 매트릭스에서 만들어지지만 정확하지 않을 수 있습니다. 보정 곡선의 농도 범위는 예상 알 수 없는 샘플에서 브래킷을 해야 합니다. 이상적으로 예상 농도 샘플 위와 아래 몇 농도 측정된다.

많은 교정 곡선은 선형이며 m이 경사이고 b가 y-intercept인 기본 방정식 y=mx+b에 맞을 수 있습니다. 그러나 모든 곡선이 선형이 아니며 때로는 선을 얻으려면 하나 또는 두 개의 축 세트가 로그리스믹 스케일에 있습니다. 선형 회귀는 일반적으로 컴퓨터 프로그램을 사용하여 수행되며 가장 일반적인 방법은 최소 사각형 피팅을 사용하는 것입니다. 선형 회귀 분석을 통해 결정 계수라고 하는 R2 값이 주어집니다. 간단한 단일 회귀의 경우 R2는 상관 계수(r)의 제곱이며 y 값이 예측 된 선에서 얼마나 멀리 떨어져 있는지에 대한 정보를 제공합니다. 완벽한 선은 R2 값이 1이고 교정 곡선의 대부분의 R2 값은 0.95이상입니다. 교정 곡선이 선형인 경우 경사는 감도의 척도입니다: 농도 변화에 대한 신호의 변화정도입니다. 경사가 큰 가파른 선은 보다 민감한 측정을 나타냅니다. 교정 곡선은 계측기가 선형 응답을 제공하는 농도 범위인 선형 범위를 정의하는 데도 도움이 될 수 있습니다. 이 범위 외부에서는 기악 고려 사항으로 인해 응답이 테이퍼될 수 있으며 교정방정식을 사용할 수 없습니다. 이를 선형성 제한이라고 합니다.

검출 제한은 노이즈로부터 통계적으로 결정할 수 있는 가장 낮은 양입니다. 일반적으로 이것은 잡음의 3배인 신호로 정의됩니다. 검출 제한은 교정 곡선의 경사에서 계산할 수 있으며 일반적으로 S.D.가 노이즈의 표준 편차인 LOD=3*S.D./m로 정의됩니다. 잡음은 여러 측정의 표준 편차를 취하여 측정됩니다. 또는 한 추적에서 노이즈를 기준선의 표준 편차로 추정할 수 있습니다. 수량 제한은 샘플 간에 분화할 수 있고 일반적으로 노이즈의 10배로 정의되는 양입니다.

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Procedure

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1. 표준 만들기: 직렬 희석

  1. 표준의 농축 재고 솔루션을 만드십시오. 전형적으로, 화합물은 정확하게 밖으로 무게다음 양적 플라스크로 정량적으로 전송된다. 일부 용매를 추가, 샘플이 용해되도록 혼합, 다음 적절한 용매와 라인에 채우기.
  2. 직렬 희석을 수행합니다. 희석에 필요한 표준의 양을 다른 체피 플라스크와 파이펫을 가져 간 다음 용매로 라인에 채우고 혼합하십시오. 10배 희석은 전형적으로 이루어지므로 10mL 체적 플라스크의 경우 이전 희석의 1mL를 추가합니다.
  3. 더 많은 희석에 필요한 대로 계속, 다음 샘플을 만들기 위해 희석하기 위해 이전 솔루션에서 파이펫. 좋은 교정 곡선을 위해서는 적어도 5 개의 농도가 필요합니다.

2. 교정 곡선및 알 수 없는 샘플 실행

  1. UV-Vis 분광광계로 샘플을 실행하여 교정 곡선에 필요한 기악 반응을 결정합니다.
  2. 첫 번째 샘플로 읽기를 가져 가라. 체계적인 오류가 있는 경우 무작위로 샘플을 실행하는 것이좋습니다(즉, 가장 높거나 가장 높지 않음에서 가장 높지 않음에서 가장 높지 않음). 소음의 추정을 얻으려면 주어진 샘플 3-5x에서 판독값을 반복하십시오.
  3. 추가 표준 샘플을 실행하여 각 샘플에 대한 측정을 반복하여 잡음의 추정값을 얻습니다. 나중에 플롯을 만들 도록 데이터를 기록합니다.
  4. 알 수 없는 샘플을 실행합니다. 가능한 한 표준을 실행하는 것과 유사한 조건을 사용합니다. 따라서, 샘플 매트릭스 또는 버퍼는 동일해야 하며, pH는 동일해야 하며, 농도는 표준 실행의 범위에 있어야 한다.

3. 교정 곡선 만들기

  1. 스프레드시트에 데이터를 기록하고 컴퓨터 프로그램을 사용하여 데이터 대 농도를 플롯합니다. 각 점에 대해 적어도 트리플리케이트 측정을 수행한 경우 오류 막대는 각 점의 오류를 추정하기 위해 해당 측정값의 표준 편차를 플로팅할 수 있습니다. 일부 곡선의 경우 데이터를 선을 얻으려면 로그로 축으로 플로팅해야 할 수 있습니다. 교정 곡선을 제어하는 방정식은 일반적으로 미리 알려지므로 방정식에 로그가 있을 때 로그 플롯이 사용됩니다.
  2. 교정 곡선을 검사합니다. 선형으로 보이나요? 비선형으로 보이는 부분이있습니까(예: 기악 응답의 한계에 도달)? 확인하려면 모든 데이터를 소프트웨어를 사용하여 선형 회귀에 맞춥시게 합니다. 결정계수(R2)가높지 않은 경우, 선에 맞지 않는 커브의 시작 또는 끝에 있는 일부 점을 제거하고 선형 회귀를 다시 수행한다. 큰 오류 표시줄이 있기 때문에 중간에 있는 점을 제거하는 것은 허용되지 않습니다. 이 분석에서 곡선의 어떤 부분이 선형인지 결정합니다.
  3. 선형의 출력은 m이 경사이고 b가 y-intercept인 형식 y=mx+b의 방정식이어야 합니다. 경사의 단위는 y축 단위/농도이며, 이 예에서(도 1)흡광도/μM이다. y-intercept 단위는 y축 단위입니다. 결정계수(R2)가 얻어진다. R2가 높을수록 적합도가 높아진다. 완벽한 핏으로 R2의 1이 됩니다. 프로그램은 또한 경사 및 가로채기에 오류의 추정을 제공 할 수 있습니다.

4. 결과: 블루 염료의 흡수도 보정 곡선 #1

  1. 파란색 염료 #1(631nm)의 흡수를 위한 교정 곡선은아래(그림 1)를도시한다. 응답은 0에서 10 μM까지 선형입니다. 그 농도는 반응이 UV-Vis 분광포토미터의 선형 범위를 벗어났기 때문에 신호가 평준화되기 시작합니다.
  2. LOD를 계산합니다. 교정 곡선의 경사에서 LOD는 3 *S.D. (노이즈)/m입니다. 이러한 교정 곡선의 경우, 노이즈는 반복 측정의 표준 편차를 취하여 얻어졌고 0.021이었다. LOD는 3*0.021/.109=0.58 μM입니다.
  3. LOQ를 계산합니다. LOQ는 10*S.D.(노이즈)/m입니다. 이 교정 곡선의 경우 LOQ는 10*0.021/.109 =1.93 μM입니다.
  4. 알 수없는 농도를 계산합니다. 선 방정식을 사용하여 알 수 없는 샘플의 농도를 계산합니다. 교정 곡선은 알 수 없는 것이 표준 샘플의 선형 범위에 속하는 경우에만 유효합니다. 판독값이 너무 높으면 희석이 필요할 수 있습니다. 이 예에서는 알 수 없는 스포츠 음료가 1:1로 희석되었습니다. 흡광도는 0.243이고 이것은 2.02 μM의 농도에 해당했다. 따라서 스포츠 음료에서 #1 청색 염료의 최종 농도는 4.04 μM이었다.

Figure 1
그림 1. 블루 염료의 UV-Vis 흡수를 위한 교정 곡선. 왼쪽: 흡광도는 #1 있는 청색 염료의 다른 농도로 측정되었습니다. 흡광도가 1이상인 10μM 이후에 응답이 레벨오프됩니다. 오류 막대는 동일한 샘플의 반복된 측정에서 발생하며 표준 편차입니다. 오른쪽: 교정 곡선의 선형 부분은 선, y=0.109*x + 0.0286에 맞습니다. 알 수 없는 데이터는 검은색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

교정 곡선은 Aalyte에 대한 기악 반응을 이해하고 샘플에서 의 한잔량의 농도를 예측하는 데 사용됩니다.

교정 곡선은 먼저 알려진 농도의 별립 농도를 가진 표준 솔루션 세트를 준비하여 만들어집니다. 계측기 반응은 각각 에 대해 측정되고, 표준 용액의 농도 대 플롯된다. 그런 다음 이 플롯의 선형 부분을 사용하여 농도에 대한 반응을 상호 연관시킴으로써 해석물의 샘플 농도를 예측할 수 있습니다.

이 비디오는 표준 세트의 준비를 시연하고 알 수없는 농도를 가진 샘플의 분석을 보여 줌으로써 교정 곡선과 사용을 소개합니다.

교정 곡선을 준비하는 데 표준 솔루션 집합이 사용됩니다. 이러한 솔루션은 마취제의 대략적인 농도를 포괄하는 다양한 농도로 구성된다.

표준 솔루션은 종종 직렬 희석으로 준비됩니다. 먼저 애일리트의 스톡 솔루션을 준비하여 직렬 희석을 수행합니다. 스톡 솔루션은 알려진 양, 종종 하나의 크기 로 희석됩니다. 그런 다음 새 솔루션은 동일한 방식으로 희석됩니다. 이로 인해 여러 수주에 이르는 농도가 있는 일련의 솔루션이 생성됩니다.

교정 곡선은 기악 신호 대 농도의 플롯입니다. 표준의 플롯은 선형이어야 하며 방정식 y=mx+b에 맞을 수 있습니다. 이러한 농도 범위는 선형의 한계에서 벗어나므로 플롯의 비선형 부분을 버려야 합니다.

가장 적합한 선의 방정식은 계측기를 사용하여 농도와 상관관계를 맺음으로써 시료의 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 선형 범위에 있기 위해서는 플롯의 선형 범위 외부에 있는 측정값이 있는 샘플을 희석해야 합니다.

계측기의 검출 한계 또는 노이즈에 대해 통계적으로 결정할 수 있는 가장 낮은 측정은 교정 곡선에서도 계산할 수 있다. 빈 샘플은 여러 번 측정됩니다. 검출 제한은 일반적으로 표준 편차의 3배에 달하는 평균 빈 신호로 정의됩니다.

마지막으로 정량화 한도도 계산할 수 있습니다. 정량화의 한계는 정확하게 정량화 될 수있는 음염의 가장 낮은 양이다. 이는 빈 신호 보다 10개의 표준 편차로 계산됩니다.

이제 교정 곡선의 기본을 배웠으니 실험실에서 교정 곡선을 준비하고 사용하는 방법을 살펴보겠습니다.

먼저, 표준의 농축 재고 용액을 준비한다. 표준을 정확하게 계량하고 볼륨 플라스크로 옮습니다. 소량의 용매를 추가하고 샘플이 용해되도록 혼합합니다. 그런 다음 용매로 라인을 채웁니다. 샘플과 동일한 용매를 사용하는 것이 중요합니다.

표준을 준비하기 위해 피펫은 체적 플라스크에서 필요한 양을 피펫합니다. 그런 다음 플라스크를 용매로 라인에 채우고 섞습니다.

스톡 솔루션에서 파이프를 하고 희석하여 표준을 계속 만들 수 있습니다. 좋은 교정 곡선을 위해서는 적어도 5 개의 농도가 필요합니다.

이제 교정 곡선에 필요한 기악 반응을 결정하기 위해 분석 기기로 샘플을 실행하십시오.

첫 번째 표준의 측정을 수행합니다. 체계적인 오류가 있는 경우 를 대비하여 표준을 임의로 실행합니다. 각 표준 3-5x를 측정하여 소음을 추정합니다.

나머지 표준을 측정하여 각각의 측정값을 반복합니다. 모든 데이터를 기록합니다.

마지막으로 샘플을 실행합니다. 표준에 사용된 것과 동일한 샘플 매트릭스 및 측정 조건을 사용합니다. 샘플이 표준 범위와 계측기의 한계 내에 있는지 확인합니다.

교정 곡선을 구성하려면 컴퓨터 프로그램을 사용하여 데이터를 신호 대 농도로 플롯합니다. 각 데이터 포인트에 대해 반복된 측정의 표준 편차를 사용하여 오류 막대를 만듭니다.

비선형인 곡선의 부분을 제거한 다음 선형 회귀를 수행하고 가장 적합한 선을 결정합니다. 출력은 양식 y = m x + b의 방정식이어야 합니다. R2-값이 1 에 가까운 좋은 적합을 나타냅니다.

이것은 631 nm에서 측정된 청색 염료 #1 위한 교정 곡선입니다. 응답은 0~15mM 사이입니다.

가장 적합한 선의 방정식을 사용하여 샘플의 농도를 계산합니다. 시료의 흡수도는 0.141이고, 6.02mMM의 농도에 대응하였다.

이제 UV-Vis 분광포토미터에서 교정 곡선을 사용하는 방법을 살펴보았으니 다른 유용한 응용 프로그램을 살펴보겠습니다.

전극 신호가 용액의 이온 농도로 보정되어야 하기 때문에 교정 곡선은 전기 화학 응용 분야에서 자주 사용됩니다. 이 예에서, 불소에 대한 이온 선택적 전극에 대한 데이터가 수집되었다.

줄을 얻으려면 농도 데이터를 로그 스케일에 그려야 합니다. 이러한 교정 곡선은 치약이나 식수와 같은 용액에서 불소의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다.

고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC는 분석 화학에 많이 사용되는 분리 및 분석 기술입니다. HPLC는 분자가 크로마토그래피 컬럼의 길이를 이동하는 데 필요한 시간에 따라 혼합물의 구성 요소를 분리합니다. 이 시간은 분자의 화학 적 특성의 범위에 따라 달라집니다.

분자의 용출은 검출기를 사용하여 측정되어 크로마토그램을 생성합니다. 피크 영역은 인기있는 소다 성분의 이 예와 같이 표준 솔루션의 범위의 간단한 교정 곡선을 사용하여 농도와 상관 될 수 있습니다.

경우에 따라 솔루션 매트릭스가 솔루트 의 측정을 방해하는 경우 고전적인 교정 곡선이 부정확할 수 있습니다. 이러한 경우 수정된 교정 곡선이 준비됩니다. 이를 위해 다양한 표준 솔루션 볼륨이 샘플에 추가됩니다. 농도 플롯에 대한 신호가 생성되며, 여기서 x 차단은 샘플 용액의 원래 농도와 동일합니다. 이 기술에 대한 자세한 내용은 JoVE 과학 교육 비디오인 "표준 추가 방법"을 참조하십시오.

당신은 교정 곡선에 JoVE의 소개를 보았다. 이제 교정 곡선이 사용되는 위치, 이를 만드는 방법 및 샘플 농도 계산하는 데 사용하는 방법을 이해해야 합니다.

언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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교정 곡선은 분석 화학, 생화학 및 제약 화학 분야의 많은 분야에서 사용됩니다. 분광법, 크로마토그래피 및 전기 화학 측정과 함께 사용하는 것이 일반적입니다. 교정 곡선은 토양 샘플에서 환경 오염 물질의 농도를 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 뇌 액의 샘플에서 신경 전달 물질의 농도 결정 사용할 수 있습니다., 제약 샘플에 비타민, 또는 음식에 카페인. 따라서 교정 곡선은 환경, 생물학적, 제약 및 식품 과학 응용 분야에서 유용합니다. 교정 곡선을 만드는 데 있어 가장 중요한 부분은 시료 혼합물과 밀접하게 근사하는 매트릭스에 있는 정확한 표준 샘플을 만드는 것입니다.

전기화학 보정 곡선의 예가아래(그림 2)를도시한다. 데이터는 불소용 이온 선택적 전극으로 수집되었다. 전기화학 데이터는 Nernst 방정식 E=E0 + 2.03*R*T/(nF) * 로그 C를 따릅니다. 따라서, 농도 데이터(x축)는 선을 얻기 위해 로그 스케일에 그려야 한다. 이 교정 곡선은 치약이나 식수의 불소 농도를 측정하는 데 사용될 수 있습니다.

Figure 2
그림 2. 이온 선택적 전극에 대한 교정 곡선. 불소의 다른 농도에 대한 불소 선택적 전극(mV 내)의 반응이 플롯된다. 전극 응답에 대한 예상 방정식은 25°C에서 y(mV)=-59.2*로그 x+b입니다. 실제 방정식은 y=-57.4*로그 x +56.38입니다. R2 값은 0.998입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Transcript

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