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Rilevamento di batteriofagi in campioni ambientali
 
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Rilevamento di batteriofagi in campioni ambientali

Overview

Fonte: Laboratori del Dr. Ian Pepper e del Dr. Charles Gerba - Università dell'Arizona
Autore dimostrativo: Alex Wassimi

I virus sono un gruppo unico di entità biologiche che infettano sia gli organismi eucariotici che procariotici. Sono parassiti obbligati che non hanno capacità metabolica e, per replicarsi, si basano sul metabolismo dell'ospite per produrre parti virali che si auto-assemblano all'interno delle cellule ospiti.

I virus sono ultramicroscopici, troppo piccoli per essere visti con il microscopio ottico, visibili solo con la maggiore risoluzione del microscopio elettronico. Una particella virale è costituita da un genoma di acido nucleico, DNA o RNA, circondato da un rivestimento proteico, noto come capside, composto da subunità proteiche o capsomeri. In alcuni virus più complessi, il capside è circondato da un involucro lipidico aggiuntivo e alcuni hanno appendici superficiali o code simili a punte.

I virus che infettano il tratto intestinale di esseri umani e animali sono noti come virus enterici. Sono escreti nelle feci e possono essere isolati dalle acque reflue domestiche. I virus che infettano i batteri sono noti come batteriofagi e quelli che infettano i batteri coliformi sono chiamati colifagi (Figura 1). I fagi dei batteri coliformi si trovano ovunque si trovino i batteri coliformi.

Figure 1
Figura 1. Colifago T2.

Principles

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I batteriofagi sono studiati nelle scienze ambientali perché sono una componente critica dei sistemi biologici. Sono l'entità biologica più abbondante sulla terra e sono importanti perché aiutano a controllare le popolazioni batteriche, i processi della rete alimentare, i cicli biogeochimici, oltre a migliorare la diversità procariotica attraverso il trasferimento genico orizzontale. Ci sono anche prove che i fagi sono indicatori surrogati affidabili per i virus enterici che causano malattie che sono anche trasmessi fecalmente ma difficili da misurare. La disponibilità di metodi relativamente rapidi ed economici per enumerare i batteriofagi li rende uno strumento interessante per la valutazione della contaminazione fecale nei campioni ambientali.

I colifagi in acqua vengono analizzati mediante l'aggiunta di un campione all'agar morbido o sovrapposto insieme a una coltura di E. coli nella fase di log della crescita. Il fago si attacca alla cellula batterica e lisi i batteri. I batteri producono un prato confluente di crescita ad eccezione delle aree in cui il fago è cresciuto e ha llisi dei batteri. Queste aree chiare risultanti sono conosciute come placche. Una sovrapposizione di agar morbido viene utilizzata per limitare la diffusione fisica dei virus in modo che, dopo la lisi da un batterio, possano diffondersi solo alle cellule batteriche vicine.

Per ottenere una formazione ottimale della placca è importante che i batteri ospiti si trovano nella fase di log della crescita. Ciò garantisce che tutti i fagi si attacchino a batteri vivi e producano progenie. Ciò richiede che una coltura di batteri ospiti sia preparata ogni giorno che viene eseguito un test. Di solito, una coltura viene incubata il giorno prima del test in modo che sia nella fase stazionaria. Il giorno del test, la coltura viene utilizzata per inoculare un brodo, che viene incubato per ottenere un numero sufficiente di batteri ospiti nella fase di log per il test (questo di solito richiede 2-3 ore di incubazione in un bagno d'acqua agitato a 35-37 ° C).

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Procedure

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  1. Ottenere un campione di acque reflue o acqua contenente colifagi.
  2. Diluire il campione 1:10 e 1:100 utilizzando il buffer Tris. Fallo trasferendo 1,0 ml di coltura a 9 ml di tampone Tris e quindi effettuando una seconda diluizione di 10 volte.
  3. Sciogliere tre tubi di agar morbido (0,7% di agar nutriente o agar di soia triptasi per tubo da 3 ml) mettendoli in un bagno di vapore o in autoclave.
  4. Mettere l'agar a bagnomaria a 45-48 °C per 15 minuti per consentire alla temperatura dell'agar di adattarsi a 45 °C.
  5. Alla prima provetta, aggiungere 1 mL di una coltura di brodo in fase logaritmica di E. coli1 e 1 mL di campione non diluito.
  6. Rimuovere il tubo dal bagno d'acqua e oscillare delicatamente tra le mani per mescolare la sospensione per 2-3 s.
  7. Pulire l'acqua dal tubo con un tovagliolo di carta e versare l'agar su una capsula di Petri precedentemente preparata contenente agar inferiore (agar nutriente regolare o agar di soia triptasi).
  8. Ruotare rapidamente la piastra per stendere l'agar superiore. Assicurati che l'agar copra l'intera superficie.
  9. Ripetere i passaggi 5-8 con gli altri due tubi di agar morbido, utilizzando 1 mL di batteri e 1 mL di diluizione del campione (Figura 2).
  10. Dopo che l'agar si è solidificato, invertire le piastre di Petri e incubare a 37 °C per 48 ore. Eliminare l'umidità dal coperchio della capsula di Petri. Se una goccia di umidità cade su una placca, causerà la diffusione del virus sulla superficie dell'agar.
  11. Dopo l'incubazione, contare il numero di placche su ogni diluizione (Figura 3) e calcolare la concentrazione di fagi nel campione originale. Registrare eventuali differenze importanti nelle dimensioni o nell'aspetto delle placche.

Figure 2
Figura 2. Procedura per la preparazione di un prato batterico utilizzando l'agar superiore per l'enumerazione dei colifagi.

Figure 3
Figura 3. Placche fagiche su un prato batterico.

1E. coli ceppo ATCC 15597 di solito produce il maggior numero di placche da campioni di acque reflue. Deve essere coltivato durante la notte in un matraccio Erlenmeyer da 250 mL contenente 100 mL di brodo di soia nutriente o triptasi e incubato in condizioni di agitazione a 35 °C. 3 ore prima del saggio fagico inoculare un mL di questa coltura in un matraccio fresco contenente 100 ml di brodo di soia nutriente o triptasi e posto in un bagno d'acqua tremante a 35-37 °C. Ciò garantirà che i batteri siano nella fase di log della crescita.

I virus sono particelle biologiche infettive che sono responsabili di molte malattie, raffreddore e influenza, per l'epatite e l'HIV.

I virus sono particelle biologiche costituite da un genoma di DNA o RNA, avvolto all'interno di un rivestimento proteico noto come capside, a volte con un involucro lipidico aggiuntivo. I virus non hanno alcuna capacità metabolica o riproduttiva da soli e devono invadere le cellule viventi e dirottare i loro macchinari cellulari per fare più copie di se stessi.

Sia le cellule procariotiche, come i batteri, che le cellule eucariotiche, come quelle degli esseri umani, possono essere infettate da specifiche classi di virus. In particolare, i batteriofagi sono virus che infettano i batteri. Ad esempio, i colifagi sono quei fagi che infettano E. coli, un comune batterio intestinale, alcuni ceppi dei quali possono causare intossicazione alimentare e che è un'indicazione di contaminazione fecale dell'approvvigionamento idrico.

Mentre i fagi stessi non sono generalmente noti per essere patogeni negli esseri umani, ci sono prove che sono indicatori surrogati affidabili per gli enterovirus che causano malattie che sono anche trasmessi fecalmente ma difficili da misurare. La disponibilità di metodi relativamente rapidi ed economici per enumerare i batteriofagi li rende uno strumento interessante per la valutazione della contaminazione fecale nei campioni ambientali.

Questo video introdurrà i principi alla base dell'enumerazione dei fagi; dimostrare un protocollo per quantificare i fagi, noto come test della placca; e infine, esplorare diverse applicazioni di scienze ambientali per il rilevamento e il conteggio di fagi e altri virus.

I batteriofagi, come tutti i virus, devono parassitare le cellule viventi, in questo caso i batteri, per riprodursi.

I fagi lo fanno atterrando e attaccandosi alla superficie cellulare batterica e iniettando i loro materiali genetici nella cellula. Una volta all'interno della cellula, il genoma virale viene replicato e vengono prodotti i componenti proteici del capside virale, entrambi utilizzando il macchinario biochimico della cellula ospite. Una volta che le particelle di fagi sono assemblate, vengono rilasciate dai batteri, spesso lysing l'ospite e scoppiando, uccidendo la cellula ospite nel processo.

Un metodo ampiamente utilizzato per determinare la concentrazione di fagi in un campione sfrutta questa attività titica. In questa tecnica, il fago del campione viene miscelato con batteri e agar morbido. Questa miscela viene versata su piastre di Petri con agar normale come substrato e lo strato superiore forma una sovrapposizione.

I batteri sono ad una concentrazione così alta che formano un prato continuo. I batteri dovrebbero essere ottenuti da una coltura che si trova nella fase di log della crescita, per garantire che ogni batterio che i fagi infettano sia vivo e consenta al fago di produrre progenie.

Quando una particella fagica infetta e lisi un batterio, la progenie del fago si diffonderà alle cellule batteriche vicine e continuerà l'infezione. L'agar morbido limita la diffusione delle particelle fagiche. Alla fine, si formerà un'area di compensazione, nota come placca.

Se il fago viene diluito a una concentrazione abbastanza bassa, sul prato batterico si possono osservare placche individuali discrete. Questi possono essere contati e utilizzati per calcolare il numero di unità di formazione della placca, o PPU, di fagi per ml del campione originale.

Ora che hai capito come i fagi infettano i batteri e come questa attività può essere utilizzata per misurare la concentrazione dei fagi, passiamo attraverso un protocollo per l'utilizzo di un test della placca per enumerare i fagi nei campioni di acqua ambientale.

Un giorno prima di eseguire il test, inoculare una colonia di E. coli ceppo ATCC 15597 in 100 ml di brodo di soia triptasi in un matraccio Erlenmeyer da 250 mL. Incubarlo con agitazione a 35 °C durante la notte.

3 ore prima del test, inoculare 1 mL della coltura notturna di E. coli in un fresco 100 mL di brodo. Mettere questa nuova cultura in un bagno d'acqua tremante ad una temperatura compresa tra 35 e 37 °C. Ciò garantisce che i batteri siano nella fase di log della crescita quando inizia il test.

Per avviare il test della placca, effettuare diluizioni seriali 10 e 100 volte del campione d'acqua, utilizzando 9 ml di tampone Tris.

Usando un bagno di vapore, sciogliere tre tubi da 5 ml di agar morbido al 0,7%, soia triptasi o agar nutriente. Una volta sciolto, porre a bagnomaria a 45-48 °C per almeno 15 minuti affinché la temperatura dell'agar scenda a 45 °C.

Al primo tubo di agar morbido, aggiungere 1 mL della coltura di E. coli in fase logaritmica precedentemente preparata e 1 mL del campione di acqua non diluita. Rimuovere il tubo dal bagno d'acqua e oscillare delicatamente tra le mani per 2-3 s per mescolare la sospensione.

Versare l'agar morbido su una capsula di Petri precedentemente preparata con soia triptasi o agar nutriente. Ruotare rapidamente la piastra per diffonderla, assicurandosi che copra l'intera superficie.

Ripetere l'inoculazione e la placcatura per gli altri due tubi, utilizzando 1 mL di ciascuno dei campioni diluiti.

Una volta che l'agar superiore si è solidificato, invertire i piatti e incubarli a 37 °C per 48 ore.

Dopo l'incubazione, conta il numero di piaghe su ogni piatto. Dal conteggio, calcolare la concentrazione di fagi nel campione originale

Ad esempio, se sono state ottenute 9 placche dalla piastra di diluizione 10 volte, allora ci sono 9 volte 10 divise per 1 ml o 90 PPU / mL di colifago nel campione di acqua originale.

Ora che hai visto come vengono eseguiti i test della placca fagica, diamo un'occhiata a come i saggi della placca possono essere utilizzati per enumerare i fagi e altri tipi di virus da una varietà di fonti.

I metodi basati sul test della placca possono essere utilizzati per isolare il batteriofago da diversi campioni ambientali come il suolo. In questo esempio, i ricercatori hanno prima raccolto i fagi dal suolo mediante filtrazione. Il fago è stato quindi utilizzato per infettare i comuni batteri del suolo Arthrobacter in un test della placca. I fagi sono stati prelevati da singole placche e striati su nuove piastre di agar, e poi sovrapposti con agar superiore contenente batteri. La concentrazione dei fagi diminuisce lungo la lunghezza della striscia, in modo da ottenere placche discrete, probabilmente formate da un singolo tipo di fago. Queste singole placche potrebbero quindi essere raccolte per analizzare ulteriormente i fagi all'interno.

Oltre ai batteriofagi, i saggi della placca possono essere eseguiti anche con altri virus, compresi quelli, come l'influenza, che infettano i mammiferi. Per fare questo, le cellule di mammifero vengono prima cresciute come monostrati in piatti di coltura tissutale. I mezzi contenenti i virus vengono quindi aggiunti alle cellule per consentire l'infezione, prima che le cellule siano sovrapposte con un mezzo immobilizzante come l'agarose gelatinoso. Dopo un periodo di incubazione che potrebbe durare fino a due settimane, le cellule infette vengono fissate e macchiate per consentire la visualizzazione e il conteggio delle placche.

Infine, oltre ai campioni raccolti dall'ambiente, i saggi della placca sono utili per rilevare ed enumerare i virus nei campioni di tessuto di individui infetti. Qui, i ricercatori hanno ottenuto e omogeneizzato tessuti polmonari da topi infetti da gamma-herpesvirus. Questo omogeneo contenente virus è stato quindi utilizzato per infettare la coltura cellulare di mammiferi. Il numero di placche potrebbe quindi essere contato per fornire una stima del titolo virale nei tessuti polmonari infetti.

Hai appena visto il video di JoVE sul rilevamento di batteriofagi in campioni ambientali. Ora dovresti capire la biologia di base dei fagi, come eseguire un test della placca per quantificare i fagi in un campione ambientale e come i saggi della placca possono essere utilizzati per studiare i fagi e altri virus in campioni ambientali o clinici. Come sempre, grazie per aver guardato!

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Results

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Diluizione del campione di acque reflue = 10-1

Numero di placche ottenute = 9

Pertanto, concentrazione di fagi nel campione di acque reflue
= 10 x 9 ÷ 1 ml
= 90 unità formanti placche / mL

Le acque reflue grezze contengono in genere10 310 4 colifagi per ml, con un intervallo di 102 – 108 per ml.

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Applications and Summary

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Ci sono molte potenziali applicazioni dei colifagi come indicatori ambientali. Questi includono il loro uso come indicatori di contaminazione delle acque reflue, l'efficienza del trattamento delle acque e delle acque reflue e la sopravvivenza di virus e batteri enterici nell'ambiente. L'uso di batteriofagi come indicatori della presenza e del comportamento di batteri enterici e virus animali è sempre stato attraente a causa della facilità di rilevamento e del basso costo associato ai saggi fagici. Inoltre, possono essere quantificati in campioni ambientali entro 24 ore rispetto a giorni o settimane per i virus enterici.

1E. coli ceppo ATCC 15597 di solito produce il maggior numero di placche da campioni di acque reflue. Deve essere coltivato durante la notte in un matraccio Erlenmeyer da 250 mL contenente 100 mL di brodo di soia nutriente o triptasi e incubato in condizioni di agitazione a 35 °C. 3 ore prima del saggio fagico inoculare un mL di questa coltura in un matraccio fresco contenente 100 ml di brodo di soia nutriente o triptasi e posto in un bagno d'acqua tremante a 35-37 °C. Ciò garantirà che i batteri siano nella fase di log della crescita.

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