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离子交换色谱法

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离子交换色谱法广泛应用于分离和孤立的带电的化合物,特别是大型生物分子。

这种类型的高效液相色谱法使用列填充固定相珠,称它为树脂。技术分离物基于它们与带电树脂的亲和力。

有两种主要类型的这种技术。在阳离子交换色谱中,负电荷的树脂用于绑定带正电的分析物。同样,在阴离子交换,负电荷的分析物将绑定到带正电的树脂。未绑定的化合物洗通过列,并被分析物然后可以在一个单独的容器收集。

这个视频将介绍基本的离子交换层析,并证明了技术分离蛋白质混合物在实验室里。

固定相是成功分离的一个关键组成部分。强阳离子交换树脂通常功能强酸性官能团,如磺酸。弱阳离子交换树脂功能弱的人群,如羧酸。

同样,强阴离子交换树脂利用强碱,如第四纪的胺,而弱阴离子交换树脂使用二级或三级胺。树脂的选择将取决于样品混合物的性质和感兴趣的被分析物。

缓冲器,统称为流动相,也是重要的分离,特别是 ph 值。蛋白质,ph 值是基于其等电点或 pI 而选择的。在 ph 值等于蛋白质的 pI,蛋白质是中性的。以上 pI,它将有一个净的负电荷,下面 pI,它会有净正电荷。必须选择 ph 值的缓冲区,因此蛋白质是适当带电并且能够绑定到固定相。

离子交换色谱法一般是四个步骤。首先,包含任一阴离子或阳离子交换树脂填充的柱被平衡使用的缓冲区。对于阴离子交换色谱柱,这涉及到树脂,确保它带正电荷的质子给予。

接下来,该示例加载在列上。缓冲区必须具有低电导率,如带电的粒子媲美的相互作用与树脂的采样。化合物的相反的电荷将绑定到树脂。分子不收费的或带有相同的电荷,保持未绑定。

在第三步,列被洗与额外的缓冲区,从列,留下绑定删除未绑定的组件。

最后,第四步是绑定分析物的洗脱。这被完成由使用盐的梯度,在盐浓度逐渐增加,或使用高盐的洗脱缓冲液。

如低盐会最容易打扰他们对树脂的离子键,将第一次,洗脱弱约束的分子。更强烈绑定的化合物将洗脱盐浓度高。

现在,概述了离子交换色谱法的基本知识,让我们看看其使用两种蛋白质的分离。

首先,要准备分离蛋白质混合物,添加 0.2 毫升的绑定缓冲区和涡拌匀。然后,离心混合物来删除任何泡沫。制备阳离子交换柱,钳它垂直上环站,并允许树脂来解决。

打开顶盖的列,然后底部。允许要滴出来到管其下的重力作用下的缓冲区。

准备列中,平衡通过加载列卷的缓冲区,在这个案例的 0.3 毫升。让滴的列,入废瓶的缓冲区。缓冲区的列卷已退出后,重复平衡的步骤。

若要运行实验,放置标记"未绑定 1"所在列下面的 2 毫升离心管。仔细地加载 0.1 毫升到该列顶部的蛋白样品。

一旦样品已加载,洗柱体积的缓冲区,并允许它一路流过。重复上述步骤共 5 洗的。收集每次洗涤管,标记为"未绑定 1"至"5"。最后 2 洗,离心试验为 10 列 s 以确保所有未绑定的物种洗掉列。将列放在一个新的 2 毫升离心收集管和"绑定 1"的标签。负载 1 柱体积的洗脱缓冲液立柱的顶端。10 离心机在 1,000 x g s。

多次重复洗脱步骤 2 以确保绑定被分析物的集合。标签管"绑定的 2"和"3"。任何颜色的变化或对分数的观察记录。

在此示例中,血红蛋白和细胞色素 C 被分开。血红蛋白具有 pI 6.8,而细胞色素 C 具有 10.5 pI。在 ph 值 8.1 缓冲区中,血红蛋白带负电荷的离子和没有绑定到列。相反,细胞色素 C 在 ph 值 8.1 带正电并绑定到列。

血红蛋白,带褐色的彩色蛋白,被发现的未绑定的分数,而细胞色素 C,带红色的彩色蛋白,有人在绑定的分数。

有许多形式的液相色谱法,每个都有不同的能力来分离组分的混合物。

在此示例中,柱层析法用于分离单、 双链 DNA 的混合物。羟基磷灰石或医管局,是磷酸钙结晶形式通常使用作为固定相由于其带正电的钙离子。在这种情况下,医管局列是分离 DNA 的理想,因为它可以将绑定到 DNA 的负电荷的骨干。

另一种形式的柱层析法经常用于分离蛋白是固定化金属离子亲和色谱或 IMAC。在 IMAC,固定相具有一种配体与金属离子,将绑定到一个组氨酸标签蛋白的兴趣。

所有其他组件的混合物退出列。蛋白质是咪唑化合物,具有相似的结构,与组氨酸,并与金属离子结合更强烈的解决方案进行洗脱。

柱层析常见的应用是高性能液相色谱法或高效液相色谱法。高效液相色谱法鉴定和分离混合物中的生物和非生物化合物,广泛应用于分析化学。

高效液相色谱法是类似于柱色谱法证明在此视频中,除了因为它是自动化的而且在非常高的压力下操作。这允许使用较小的固定相磁珠,与更高的表面积与体积的比值。因此,在流动相中组件与固定相之间的相互作用得到改善是可能的。

你刚看了朱庇特的简介离子交换色谱法。现在,您应该了解它、 4 步骤和一些相关的技巧背后的概念。

谢谢观赏 !

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