Overview
מקור: פיימן שהביגי-רודפושטי וסינה שהבזמהאמדי, המחלקה להנדסה ביו-רפואית, אוניברסיטת קונטיקט, סטוררס, קונטיקט
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הוא מכשיר המשתמש בקרן אלקטרונים כדי לדמות באופן לא מובנה ולאפיין חומרים מוליכים בחלל ריק. כאנלוגיה, קרן אלקטרונים היא ל- SEM כמו האור למיקרוסקופ האופטי. ההבדל הוא שמיקרוסקופ האלקטרונים מניב תמונות ברזולוציה והגדלה גבוהות בהרבה. למיקרוסקופים האופטיים הטובים ביותר יש בדרך כלל רזולוציה של עד 200 ננומטר, בעוד ש- SEMs בדרך כלל טוענים לרזולוציה של 0.5 ננומטר. זאת בשל העובדה כי מיקרוסקופים אופטיים מוגבלים על ידי עקיפה של גלים, פונקציה של אורך הגל, שהוא סביב 500 ננומטר עבור אור גלוי. לעומת זאת, ה- SEM משתמש בקרן אלקטרונים אנרגטי, אשר כאורך גל של 1 ננומטר. מאפיין זה הופך אותם לכלים אמינים מאוד לחקר ננו ומיקרו מבנים. מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר גם לחקור דגימות ביולוגיות עם גדלי תכונות קטנים מדי למיקרוסקופיה אופטית.
הדגמה זו מספקת מבוא להכנת מדגם ורכישת תמונה ראשונית של דגימות ביולוגיות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. במקרה זה ייחקר פיגום תאי קולגן-הידרוקסיאפטיט (HA). סביבת הוואקום של ה- SEM והטעינה המושרה על ידי קרן האלקטרונים על דגימות שאינן מוליכות (כגון חומר אורגני) יוצרות אתגרים שיטופלו בהכנה. היתרונות והחסרונות של שיטות הדמיה שונות בכל הנוגע לרזולוציה, עומק המיקוד וסוג המדגם יידונו גם הם. מטרת הדגמה זו היא לתת למשתתף מידע נוסף על SEM כדי לקבוע אם מודול מיקרוסקופיה זה מתאים ביותר לסוג של מדגם ביולוגי.
Principles
כאשר קרן אלקטרונים בעלת אנרגיה גבוהה (הנעה בדרך כלל בין 5-30 keV) פוגעת במדגם, מגוון אותות נפלטים מהדגימה. אינטראקציות אלה יכולות לשמש לחקר טופוגרפיה, קריסטלוגרפיה, פוטנציאל חשמלי ושדות מגנטיים מקומיים. האלקטרונים עוברים שני סוגים של פיזור: אלסטיים ולא אלסטיים. פיזור אינאלסטי גורם לפליטת אלקטרונים משניים. אלקטרונים אלה בעלי אנרגיה נמוכה (~50 eV) הם האלקטרונים החיצוניים של אטומי הדגימה שרוכשים מספיק אנרגיה כדי לעזוב את פני השטח של האטום. פיזור אלקטרונים משניים מספק מידע טופוגרפי, שכן רמת האנרגיה של האלקטרונים העוזבים את אטום הדגימה אינה גבוהה מספיק כדי לעבור דרך המדגם. לכן רק מידע ברמת פני השטח נאסף על ידי הגלאי.
פיזור אלסטי, לעומת זאת, אינו נגרם על ידי אלקטרונים מנותקים מאטומי הדגימה. זוהי הקרן העיקרית של אלקטרונים לאחר אינטראקציה עם הגרעין, כפי שניתן לראות באיור 1. אלקטרונים אלה אינם משנים את האנרגיה או המהירות שלהם, אך הם משנים את הכיוון שלהם בהתבסס על האינטראקציה שלהם עם הגרעין. איתור אלקטרונים אלה מספק מידע קומפוזיציאלי, וניגודיותם המשתנה באינטראקציה עם אטומים בעלי משקלים אטומיים שונים מאפשרת למשתמש להבחין בין הבדלים בהרכב המדגם. בדגימות ביולוגיות, זה יכול לשמש כדי ללמוד חלקיקים מוטבעים או מחוברים ננו מבנים עם משקולות אטומיות כבדות יותר, כגון זהב או ברזל.
איור 1: אינטראקציות אטומיות עם האלקטרונים העיקריים (PE) וכיצד הם יוצרים את האותות השונים.
הכנת מדגם היא הליך חשוב, במיוחד עבור דגימות ביולוגיות. על מנת להשיג תמונות SEM ברזולוציה גבוהה, אלקטרונים צריכים להגיע לדגימה. לאחר מכן, האותות שהם תוצאה של האינטראקציה בין האלקטרונים לדגימה צריכים להגיע לגלאים. משמעות הדבר היא כי המכשיר חייב לעבוד תחת ואקום גבוה כדי למנוע פיזור אלקטרונים לפני הקרן מגיעה לדגימה והאותות מגיעים לגלאים. ואקום זה רגיש מאוד ויכול למשוך חומר חלקיקי מהדגימה, כלומר חשוב לוודא המדגם יבש וללא חלקיקים.
שיקול נוסף בהכנת המדגם הוא אופי קרן האלקטרונים. מכיוון שהקרן מורכבת מחלקיקים טעונים מאוד, כאשר דגימה לא מוליכת מופגזת בחלקיקים טעונים מאוד מקרן האלקטרונים, יש הצטברות של מטענים על פני השטח המשפיעים על הסטת קרן האלקטרונים וגורמים לעלייה גדולה בפיזור הקרן. על ידי ציפוי המדגם בשכבה מוליכת לפני ההדמיה, ניתן להימנע מממצאי טעינה אלה בתמונה.
השיטות המתוארות כאן חלות על רוב החומרים שאינם מוליכים. יש צורך בציפוי כדי למתן את טעינת חפציו. הפיגומים התאיים קולגן-HA נעשה על ידי שלבי הסינתזה הבאים: משקעים משותפים של קולגן עם HA לתוך ג'ל מרוכבים, יצירת רפש ויציקה להקפיא, הצלבת הפיגומים וייבוש סופי. ייבוש סופי זה הושלם במשך 5 ימים במייבש אבק ומייבש מספיק את המדגם לניתוח SEM מבלי להשפיע על המאפיינים המבניים של הפיגומים. עם זאת, כאשר תאיהדמיה , הדאגה העיקרית בעת הכנת המדגם היא שמירה על מבנה התא. שיטות קיבוע כימיות מבוססות שרף משמשות בדרך כלל לצפייה בתאים תוך שמירה על מבנה התאים, כגון קיבוע גלוטרדהיד ושרידים אפוקסי ואקריליק. בדרך כלל, glutaraldehyde משמש קיבוע שיוצר crosslinkages בציטופלסמה של תאים, אבל גם גורם טיפה ב- pH. לכן, אגירה נדרשת בעת הכנת דגימות עם glutaraldehyde. התוספת של טכניקות אלה מאפשרת למבנה התא להידמות ביותר למבנה שלו כאשר הוא היה בחיים [3].
איור 2: מעיל מקרטעת פלדיום מזהב המציג את תא הדגימה (כלי כסף למעלה) ואקום (משמאל) ומדדי זרם (מימין). במודל זה, זרם של 2 mA משמש עם ואקום תא של 0.1 torr, אשר נשמר קבוע באמצעות שסתום דליפת ארגון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Procedure
1. הכנת מדגם
- ללבוש כפפות ולנקוט באמצעי זהירות כדי למנוע זיהום בעת טיפול במדגם.
- ודא כי המדגם בשקופית מיובש ואין זיהום על המדגם. הסיבה לכך היא SEM מודד אפיון פני השטח, ופגמים אלה יכולים לעכב קשות את האות.
- אם המדגם נטען על שקופית זכוכית סטנדרטית, להקטין את גודל המדגם על ידי ניקוד השקופית עם חותך זכוכית עם קצה יהלום בקו ישר ולדחוף בעדינות על קו הניקוד הרחק מהגוף עד הזכוכית נשברת.
- בהתאם לדגימה, בחר ציפוי שאין לו את אותו הרכב אלמנטרי (זה יעכב את האות שהתקבל על ידי EDS). להדגמה זו, נעשה שימוש בציפוי פלדיום מזהב.
- השתמש במעיל המחבט לפי ההוראות. תן למכונה לרחוט את המדגם בסביבות 40 s לציפוי דק עם כיסוי הולם.
- הר את הדגימה על ספח SEM באמצעות סרט פחמן דו-צדדי מוליך. יש למקם קלטת זו גם מהבמה לחלק העליון של השקופית שהוטחה לקרקע את המדגם אם היא מותקנת על שקופית שאינה מוליכת. שכבה דקה של צבע כסף מוליך יכולה לשמש גם כדי להגדיל את המוליכות של המדגם לשלב.
- הר את הספח על הבמה ולהדק את הבורג בצד.
2. הליך הדמיה
- תעמיסו את הבמה לתא. תסגור ותאטם את הדלת. לאחר מכן לחץ על כפתור "העברה" כדי לפתוח את המעבר מתא הטעינה אל הוואקום.
- ברגע שלחצן ההעברה מפסיק להבהב ודלת הפנימית פתוחה, ניתן להעביר את הדגימה לתא הוואקום על ידי הברגה במוטות המתכת ולדחוף את הדגימה לתא.
- פתחו את המוט, נסוגו ואבטחו את המוט במלואו לתא העומס, ולחצו על "לאחסן" כדי לסגור את תא העומס מתא הוואקום. המדגם נטען כעת ושאר התהליך מתבצע מתחנת העבודה של המחשב.
- הזז את הבמה באמצעות הבקר ועל-ידי פתיחת לוח הניווט של השלב עד שהוא יהיה בשדה הראייה שלך.
- הזז את המדגם אנכית עד מרחק העבודה הוא 5-10 מ"מ. בעת הזזת הבמה בכיוון z, הפעל את מצלמת התא כדי להבטיח שהדגימה שלך לא תגיע קרוב לאקדח האלקטרונים.
- הפעל את קרן המתח הגבוהה הנוספת (EHT). שים לב שייתכן שתצטרך גם לפתוח את העמודה אם היא מבוטלת מזה זמן מה.
- בחר את אות SE2 מאפשרויות הגלאי.
- השתמש בהגדרת kV של כ- 5 kV להדמיה ראשונית ולאחר מכן הגדל ל- 20-30 kV לקבלת אות נוסף באמצעות מצב הפיזור האחורי. אם המדגם לא היה מצופה, שמור על keV נמוך כדי למנוע יותר מדי חפצי טעינה בתמונה ולמנוע נזק לדוגמה.
- אם אין תמונה ברורה, סובב את המוקד, הבהירות וידיות הניגודיות עד שמבנה נראה לעין. זו תהיה התייחסות לעידון.
- סובבו את ידית המיקוד במצב גס עד לתמונה גלויה. לאחר מכן עבור בסדר כדי למצוא את המיקוד הטוב ביותר.
- השתמש בניווט שלבים (לא בכיוון z) ובהגדלה כדי למצוא אזור שממנו יש לשמור תמונה.
- הקטינו את מהירות הסריקה והדליקו את הקו בממוצע כדי להשיג תמונה טובה יותר לשמירה.
- שמור את התמונה על-ידי לחיצה ושמירה באמצעות לחצן העכבר הימני במיקום קובץ.
- הכנס את ה- BSD והזז את הבמה בחזרה למיקום z שבו המדגם ממוקד.
- חזור על שלבים 8-11 בעת חיפוש אזורי ניגודיות המצביעים על מספר אטומי גבוה יותר.
- הסר את ה- BSD בסיום.
- כאשר אתה מוכן להסיר את המדגם, לחץ על הכפתור "להחליף".
- העבר את המדגם בחזרה לתא העומס ולוץ "חנות" ואז "פורקן".
סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים, או SEM, משמשת לעתים קרובות לצילום חומרים ביולוגיים בסולם הננו. מיקרוסקופים אופטיים, המשתמשים באור כדי לדמיין דגימה, משמשים במידה רבה לדגימות ביולוגיות שאינן הרסניות, אולם הרזולוציה ועומק השדה שלהם מוגבלים, ולכן SEM משמש על מנת להשיג רזולוציה גבוהה יותר עד ננומטר אחד.
ב- SEM, קרן אלקטרונים מתמקדת באמצעות סדרה של עדשות מעבים, אשר לאחר מכן פוגע במדגם. כאשר הקרן פוגעת במדגם, אלקטרונים על פני השטח מפוזרים ונמדדים על ידי הגלאי.
בסרטון זה, נדון כיצד SEM עובד, להדגים כיצד לדמיין מדגם ביולוגי במעבדה, ולבסוף, להציג כמה טכניקות המשמשות לצילום דגימות רגישות.
מיקרוסקופ אלקטרונים סורק משתמש בקרן אלקטרונים בעלת אנרגיה גבוהה, הנוצרת על ידי אקדח אלקטרונים המצויד בקתודה של חוט. האלקטרונים הנוצרים נדחפים לכיוון האנודה ולאחר מכן מתמקדים באמצעות עדשות מעבים לפני הכניסה לעדשה האובייקטיבית. העדשה האובייקטיבית מכוילת כדי למקד את הקרן במדגם, שם היא נסרקת על פני השטח. האינטראקציות של האלקטרונים עם האטומים במדגם משמשות לחקר הטופוגרפיה, ההרכב היסודי והגבישיות של המדגם. כאשר קרן האלקטרונים של התקרית פוגעת בפני השטח, היא פולטת אלקטרונים משניים ומוחזרים. אלקטרונים משניים הם אלקטרונים בעלי אנרגיה נמוכה הנפלטים מהדגימה הקרובה לפני השטח ומספקים מידע טופוגרפי.
אלקטרונים מכווצים בגב, לעומת זאת, משתקפים בכיוון ההפוך של קרן האירוע. עוצמת האינטראקציה עולה עם הגדלת המשקל האטומי, ומאפשרת למשתמש להבחין בין הבדלים קומפוזיציה. יש צורך בשיקול מיוחד כדי לדמיין דגימות ביולוגיות עם SEM, שכן SEM משתמשת בוואקום גבוה, ולכן דגימות ביולוגיות, אשר בדרך כלל יש תוכן מים גבוה, חייב להיות מיובש קודם. זה יכול לגרום לקריסת המבנה של דגימות רגישות, במיוחד תאים. לכן, תאים מטופלים עם קיבוע, שטוף, ולאחר מכן מיובש לאט על ידי כביסה עם כמויות הולכות וגדלות של אתנול.
עבור חומרים ביולוגיים נוקשים, כגון פיגום רקמת קולגן-הידרוקסיאפטיט המשמש בהדגמה זו, המדגם מיובש על פני תקופה של מספר ימים תחת ואקום גבוה.
לבסוף, מאז הדמיית SEM טיפוסית דורש משטח מוליך, דגימות ביולוגיות הם לעתים קרובות sputter מצופה בשכבה דקה של מתכת לפני הדמיה. כעת, לאחר שדנו כיצד SEM פועלת וכיצד להכין דגימה ביולוגית להדמיה, בואו נבחן כיצד להכין ולדמיין פיגום רקמת קולגן-הידרוקסיאפטיט.
ראשית, הר את הדגימה הביו-חומריםית על ספח SEM באמצעות סרט פחמן מוליך וודא כי המדגם יבש ואין לו זיהום על פני השטח.
לאחר מכן, מניחים את המדגם הרכוב בתא של מעיל מקרטעת, שואבים את התא ומכסים את המדגם במשך כ -40 שניות כדי להשיג ציפוי דק, ארבעה עד שישה ננומטר של מתכת, במקרה זה זהב, עם כיסוי הולם. לאחר מצופה, להסיר את המדגם ולהשתמש סרט מוליך כדי לחבר את הספח לחלק העליון של המדגם, אשר כעת מצופה מתכת מוליך.
לבסוף, הר את הספח על במת SEM והידק את הבורג בצד. כעת המדגם מוכן לתמונה עם SEM. ראשית, לטעון את הבמה לתוך תא SEM ולאטום את הדלת, ולאחר מכן לחץ על כפתור ההעברה כדי לפתוח את המעבר מתא הטעינה אל הוואקום. ברגע שהדלת הפנימית פתוחה, בורג מוט המתכת לתוך הבמה ולדחוף את המדגם לתוך תא הוואקום, ואז לפתוח את מוט המתכת ולחליק אותו לחלוטין לתוך תא העומס, ולאחר מכן לחץ על חנות כדי לסגור את תא הוואקום.
עכשיו בואו נצלם את המדגם באמצעות SEM.
ראשית, הזז את השלב באמצעות הבקר ונווט את המדגם לשדה הראייה, ולאחר מכן הזז את הדגימה אנכית עד שמרחק העבודה הוא חמישה עד 10 מילימטרים. הפעל את קרן האלקטרונים ובחר את הגלאי עבור אלקטרונים משניים, הגדר את הקרן לחמישה וולט קילואלקטרון בתחילה, ולאחר מכן הגדל עד 20 עד 30 קילו-קטורונים וולט לפי הצורך. אם התמונה אינה ברורה, סובבו את המוקד, הבהירות והידיות הניגודיות עד שתופיע תמונה ברורה.
השתמש בניווט הבמה ובכיווני X ו- Y כדי לאתר נקודה חדשה במדגם, ולאחר מכן הגדל את ההגדלה עד שהתכונות הרצויות וגלויות. התאם את המיקוד, הניגודיות והבהירות לפי הצורך כדי לשפר את איכות התמונה. ייתכן שיהיה עליך להקטין את מהירות הסריקה ולהדליק את הקו בממוצע כדי להשיג תמונה טובה יותר ולאחר מכן לשמור את התמונה.
תמונות ה-SEM חושפות מבנה תלת מימדי ונקבובי ביותר עם תכונות סיביות קטנות מ-25 מיקרון. תכונות אלה יהיה קשה לדמיין באמצעות מיקרוסקופיה אופטית, כמו מיקרוסקופיה אופטית יש עומק נמוך בהרבה של שדה.
ישנם אתגרים רבים הקשורים להדמיה של מבנים ביולוגיים עם SEM, כולל קריסת מבנה או נזק מקרן אלקטרונים אנרגיה גבוהה. כעת נבחן כיצד טכניקת ה- SEM הכללית מיושמת על סוגים אלה של דגימות רגישות. מבנים ביולוגיים עדינים, כגון רקמות צמח צעירות אלה, או אלה עם תכולת מים גבוהה, חייבים להיות מטופלים באמצעות תהליך קיבעון לפני ההדמיה.
מריסטמים פרחוניים אלה טופלו מיד בתמיסה קבועה של פורמלין/חומצה אצטית שהוכנה זה עתה. הרקמה הקבועה נותרה באתנול, הונחה במיכל רשת, והתייבשה באמצעות סדרת אתנול של 70%, 80%, 90%, ו-100% אתנול. לבסוף, רקמות הצמח התייבשו באמצעות מייבש נקודות קריטי, רכוב, ו sputter מצופה ציפוי מתכת דק.
לאחר הדמיית SEM, ברור כי המבנים שלא טופלו נפגעו קשות על ידי תהליך הייבוש והראו קריסה ניכרת במבנה, בעוד אלה שתוקנו שמרו על המבנה הטבעי שלהם. לחלופין, ניתן לדמיין תאים ודגימות אחרות של תכולת מים גבוהים באמצעות SEM סביבתי, או ESEM. ESEM משתמשת בקרן אלקטרונים באנרגיה גבוהה שנסרקת מעל המדגם, כמו ב- SEM קונבנציונלי, עם זאת, היא מאפשרת הדמיה של דגימות רטובות או לא מכווצות על ידי שמירה על סביבה גזית בתוך התא.
זה נעשה על ידי הפרדת תא הוואקום הגבוה המכיל את אקדח האלקטרונים מתא הדגימה באמצעות שני צמצמים. קרן האלקטרונים דווקא גורמת להפסדים משמעותיים עקב פיזור על ידי מולקולות גז, אך היא בדרך כלל אנרגיה גבוהה מספיק להדמיה. כאן, תאים גדלו על שבב סיליקון, פונקציונלי עם נקודות קוונטיות, ותיקנו באמצעות פרוטוקול קיבוע גלוטרלדהיד. התאים צולמו במים ומראים את המבנה הלא-מכובס של התא עם נקודות קוונטיות בודדות הנראות על פני התא.
הרגע צפית בהקדמה של JoVE לדמיין ביו-חומרים באמצעות SEM. עכשיו אתה צריך להבין איך SEM עובד, איך דגימות ביולוגיות מוכנות ותמונה, כמו גם כמה יישומים של הטכניקה עבור מבנים רגישים.
תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Results
תמונות ה-SEM באיורים 3 ו-4 מראות שהמבנה המדובב הוא תלת-ממדי ביותר עם תכונות מיקרו-קנה מידה. איכות התמונה מושפעת מהמוקד ומעובי ציפוי המקרטעת.
איור 3: התמונות הבאות ממחישות כיצד המוקד לדוגמה יכול להשפיע על איכות התמונה. בתמונה מימין, כל שדה הראייה נמצא בפוקוס, בעוד שהוא לא ממוקד בצד שמאל. משחק עם פרמטרים כמו המוקד יכול לספק תמונה טובה בהרבה.
איור 4: תמונות של דגימת קולגן-הידרוקסיאפטיט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Applications and Summary
כאן הדגמנו את עומק המיקוד, שדה הראייה והרזולוציה וההגדלה המרבית של מיקרוסקופ אלקטרונים וכיצד ניתן להשתמש במאפיינים אלה כדי להציג דגימות ביולוגיות. הדגמה זו נועדה לעזור לצופים להחליט איזה מודול מיקרוסקופיה הוא הטוב ביותר עבור יישום מסוים. כפי שהודגם, ל- SEM יש עומק מיקוד גבוה מאוד, רזולוציה גבוהה בהרבה והגדלות גדולות יותר. עם זאת, הוא אינו מתאים לכל סוגי הדגימות.
הדגמה זו הציגה את עקרונות מיקרוסקופיית האלקטרונים והראתה כמה מהיישומים שלהם במעבדות מחקר. מיקרוסקופ אלקטרונים משמש לבדיקה, אפיון ובקרת איכות. לדוגמה, הם משמשים להדמיה של מעגלים משולבים,לוחות מעגלים, הפצת סדקים ומערכות ננו-אלקטרומכניות. בתחום הביולוגיה מכשירים אלה ממלאים תפקיד מפתח גם כן. ישנם אפילו מיקרוסקופים אלקטרונים שתוכננו במיוחד כדי להכיל דגימות ביולוגיות רטובות. דגימות ביולוגיות אלה נעות בין רקמות לעצמות, תאים ומיקרואורגניזמים. שימוש בגלאים נוספים יכול לאפשר ניתוח נוסף, כגון ניתוח משטח מדויק.
רשימת חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
| ציוד | |||
| ביוסמפל | |||
| מעיל פחמן או זהב | |||
| קרן צולבת-SEM | זייס | ||
| פיגומים תאיים קולגן-הידרוקסיפטיט | פותח על ידי מעבדת וויי באוניברסיטת קונטיקט |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Oatley, C. W., W. C. Nixon, and R. F. W. Pease. "Scanning electron microscopy." Advances in Electronics and Electron Physics 21 (1966): 181-247.
- Goldstein, Joseph, et al. Scanning electron microscopy and X-ray microanalysis: a text for biologists, materials scientists, and geologists. Springer Science & Business Media, 2012.
- Carol Heckman, et al. Preparation of cultural cells for scanning electron microscope. Nature Protocols Network, 2007, doi:10.1038/nprot.2007.504
