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ELISPOT 分析:检测 IFN-- 分泌性细胞
 

ELISPOT 分析:检测 IFN-- 分泌性细胞

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酶相关的免疫点,或ELISPOT,分析病原体或细胞损伤的免疫反应的方法。它允许通过检测它们分泌的特定蛋白质来量化不同免疫细胞的激活。例如,ELISPOT 通常用于通过检测分泌的细胞因子来测量 T 细胞在暴露于异物抗原时的反应。

对于基于细胞因子的ELISPOT测定,该过程从ELISPOT微孔板的涂层开始,该微孔板具有捕获抗体,该抗体特定于目标细胞因子。抗体涂层后,T细胞被添加到井中,并通过外部剂(例如抗CD3抗体)刺激。细胞然后分泌目标细胞因子,该细胞因子立即被捕获抗体固定。由于蛋白质在分泌后从活细胞中立即捕获,没有稀释或降解,因此此测定具有高精度。目标细胞因子固定后,加入检测抗体,该抗体也与捕获的细胞因子结合。

ELISPOT 技术还可用于通过分析特定抗体的产生来量化感染或疫苗接种后的记忆 B 细胞。在基于抗体的ELISPOT中,使用特定的抗原代替抗体用于捕获步骤,抗原将结合到板中,或在检测步骤中,抗原在捕获后检测目标抗体。在该过程的所有变化中,对于T细胞或B细胞,检测抗体或抗原是生物仿当的,这使得它与链球蛋白结合的检测酶结合,如马萝卜过氧化物酶。然后,在添加过氧化物酶的基质AEC后,产生一种黑暗、不溶性沉淀物。这种沉淀标记捕获的蛋白质的位置,每个分泌细胞产生一个可见点,可以使用ELISPOT读取器或显微镜进行量化。斑点的大小是每个细胞分泌的蛋白质量的相对估计值。这种测定可以检测单个细胞的免疫反应,即使在相对较小的分泌细胞亚种群中,也可用于研究细胞层面的免疫反应。

在本视频中,您将学习如何执行 ELISPOT 测定,然后量化表示分泌细胞的点。

在整个实验中,通过在层流罩中工作并戴上手套,确保无菌条件。

此协议中的所有计算均基于一个 96 孔板所需的体积。

首先,稀释抗细胞因子捕获抗体。为此,将 10 毫升缓冲液转移到无菌的 15 毫升锥形管中。然后,使用移液器将10微升每毫升1毫克的单克隆抗体添加到缓冲液中,以创建最终浓度为每毫升1微克的溶液。接下来,将捕获抗体溶液倒入无菌储液罐中,并使用多通道移液器将 100 微升分配到 96 孔 ELISPOT 板的每个孔中。

用板盖盖住板,密封以防止蒸发,并在四摄氏度下孵育过夜。第二天,在层流罩中揭开 ELISPOT 板。快速将板倒置到无菌湿巾上,从每个孔中取出捕获抗体溶液。接下来,使用多通道移液器为每个孔添加 200 微升的细胞培养基。此步骤将阻止在测定期间进行非特定绑定。更换板盖,在 37 摄氏度的培养箱中孵育两小时。

在培养板时,通过在10毫升细胞培养基中加入一微升PMA和20微升的碘霉素,制备2X线粒体溶液,最终浓度达到每毫升PMA15毫微克和一微霉素。

此时,小鼠ssss的细胞悬浮液也应在无菌罩中准备。使用显微镜和血细胞计测量细胞的浓度并调整总体积,直到达到每毫升200万个细胞的库存浓度。

孵育完成后,迅速将板倒置到无菌湿巾上,从每个孔中取出细胞培养基。接下来,在 ELISPOT 板顶行的井中加入 200 微升的制备蜂窝悬浮液溶液。在三联设置实验,以便测试的每个单元格类型将镀在一组三个分组列中。在此下方,将 100 微升普通细胞培养基添加到下五行板中,在包含蜂窝库存溶液的行下方。

接下来,通过将 100 微升的电池悬浮液从顶行移入正下方的行,执行连续稀释,轻轻上下移液以均匀分布细胞。对其余行重复此过程,在每个步骤将 100 微升从上一行移动到下面的行,直到第五行被连续稀释。仅保留第六行与细胞培养基,以用作控件。为了刺激板的实验井中的细胞,在一排到五行的每口井中加入100微升制备的线粒体溶液。请务必离开第六行,这将作为控件,不受刺激。更换盖子,在 37 摄氏度和 5% CO2 下孵育板 24 至 48 小时。

准备稀释的生物氨酸抗细胞因子检测抗体。首先,通过将5毫升10%的胎儿牛血清加入45毫升的PBS,制备50毫升的测定稀释剂。接下来,将检测抗体稀释至测定稀释剂中每毫升2微克的浓度。此外,通过混合0.05%补间-20和PBS,此时准备20至25毫升的洗涤缓冲液。

孵育完成后,解开板的盖子,并迅速反转,从井中取出所有液体。通过在每口孔中加入约 200 微升的洗涤缓冲液来洗涤盘子。通过快速反转和轻拂水槽上的盘子来排出这种液体。重复此过程四次,共进行五次。接下来,在每个井中加入100微升的稀释检测抗体溶液,更换盖子,并在室温下孵育两小时。孵育后,通过反转板并在水槽上轻拂,将检测抗体溶液从板的孔中排出。

和以前一样,用洗涤缓冲液洗板五次,每次洗涤之间排出液体。最后洗涤后,根据制造商的说明稀释链球蛋白-马萝卜过氧化物酶溶液。接下来,在板的孔是空的,添加100微升稀释链球蛋白-马萝卜过氧化物酶溶液到每个井。将盖子放回盘子上,在室温下孵育两小时。

孵育后,使用前不超过15分钟,激活预制AEC基板溶液。丢弃井内的物品,用洗涤缓冲液洗碗五次,如前一样。然后,立即将100微升制备的AEC基板溶液加入每口井中。将板留在室温下发育约 10 到 20 分钟,同时监测斑点的发育。这些斑点在井面上显示为小而暗的圆圈。然后,停止反应,用水将盘子浸在水槽上。将盘子放在纸巾上,让空气干燥过夜或直到完全干燥。取出板下的塑料托盘有助于干燥。干燥后,这些斑点已准备好使用自动板读取器计数。

在这里,使用CTL免疫点读取器,但该协议可以适用于任何读取器。然后,打开 CTL 程序并单击"扫描计数"。将托盘的弹出从机器中伸出。然后,卸下塑料适配器,并在 ELISPOT 板和适配器上对齐行 A。选择要保存的文件的文件名和位置,并将板和适配器加载到托盘上。单击"加载软件"并关闭机器侧面的门。然后,按计数后开始。确保保存文件,然后打开质量控制 QC 软件来分析数据并计算点数。此数据作为 Excel 文件导出。分析完成后,单击"弹出"以检索板。

在实验中,对野生型和肿瘤小鼠的细胞进行了镀层和分析,以进行IFN伽玛分析。请注意,斑点的数量随着细胞浓度的降低而减少。通常,ELISPOT 数据以每镀电池数的点计数数的形式显示。在此示例中,点数显示在条形图中,每个细胞浓度都列在 x 轴上。请注意,点数表示给定总体中每个细胞总数激活的细胞数。

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