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免疫組織化学と免疫細胞化学
 

免疫組織化学と免疫細胞化学:光顕微鏡による組織イメージング

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免疫細胞化学と免疫組織化学は、培養細胞および組織に関心のあるタンパク質の染色方法をそれぞれ有する。両方の関連技術の基本原理は、検出システムでタグ付けされた特定の抗体を使用してタンパク質を同定および視覚化し、細胞および組織内の位置、ならびに相対レベルを決定することを含む。いずれの実験においても、プロセスはサンプル調製から始まる。

細胞内のタンパク質または抗原の位置を特異的に可視化する免疫細胞化学の場合、これには3つのステップが含まれます。最初のステップはめっきであり、これは、カバースリップまたはスライド上の成長培地中の細胞を培養することを伴う、典型的には、培養プレートのウェル内にある。続いて固定が続き、パラホルムアルデヒドのような沈殿剤や架橋剤を細胞に加えて、タンパク質の構造的完全性を維持し、酵素活性が分解するのを防ぎます。最後のステップは透過性であり、染色のために細胞膜を透過性にするために洗剤を添加することを含む。

対応する方法では、免疫組織化学、タンパク質または抗原は組織内で可視化され、試料調製には5つのステップがある。まず、組織全体を固定し、通常はパラホルムアルデヒドを投与する。これは、パラフィンのブロックに組織を埋め込み、次に、マイクロトームと呼ばれるマシンを使用して、スライドに配置することができる薄いスライスに組織を切断するために、このブロックのセクション化が続きます。次に、スライドは、デパラフィン化、または組織スライスの周りからパラフィンの除去を行う。次に、任意抗原検索工程を行うことができる。これは、固定中に架橋されたエピトープのマスクを解除するために熱または酵素を使用して行うことができ、抗体結合のためにそれらを利用できます。適切なサンプル調製後、標的特異的一次抗体を細胞または組織試料に添加する。この一次抗体は、目的のタンパク質に結合する必要があります。次に、二次抗体を添加し、一次抗体を検出して結合する。この二次抗体は、HRPと呼ばれる酵素に結合するか、または結合することができる。その特定の基板DABが添加されると、HRPはこれを不溶性の褐色沈殿物に変換します。この茶色の染色は、標的タンパク質の位置を示す。スライドはまた、青色で核を標識し、細胞内局在を決定するための空間基準点を提供するヘマトキシリンで染色されています。その後、取り付け媒体をスライドに追加し、続いて染色されたサンプルをシールして保存するためにカバースリップを行います。最後に、スライドは軽い顕微鏡でイメージすることができる。

このビデオでは、めっきされた細胞および組織セクションのサンプル調製技術を観察し、続いて組織セクションの免疫染色を行う。

まず、目的の細胞は、カバースリップに座っている必要があります。これを行うには、組織培養フードで作業し、個々のカバースリップを24ウェルプレートのウェルに配置します。その後、サッシを閉じ、UVライトをオンにして、カバースリップを少なくとも15分間殺菌します。次に、UV ライトをオフにします。コンフルエントな10センチメートルの皿から目的の細胞を持ち上げるには、メディアを吸引し、PBSで簡単に洗浄し、2分間細胞にトリプシンを追加します。次に、プレートの側面をタップして、細胞が切り離されていることを確認し、メディアでトリプシンを中和します。次に、0 を追加します。各ウェルにセル懸濁液の5mLは、カバーリップをカバーすることを確認してください。加湿されたCO2インキュベーターにプレートを入れ、細胞が50-70%のコンフルエントになるまで37°Cで成長させることができます。

細胞が最適な合流に達したら、各ウェルから培養培地を吸引し、でそれらをインキュベートして細胞を固定します。室温で20分間1X PBSで希釈した4%パラホルムアルデヒドの5mL。固定剤を取り除き、各カバースリップの上に1X PBSの1 mLを加える細胞をすすいで下します。直ちにPBSを吸引し、その後、合計3回の洗い流しのために2回以上すすり続けた。

さて、各ウェルに1X PBSに0.1%トリトンX-100の0.5mLを加えて細胞を透過化する。プレートを室温のままに15分間放置します。透過性バッファーを吸引し、各ウェルに1x PBSの1 mLを加えて細胞をすすいで下します。直ちにPBSを吸引し、合計3回の洗い流しのためにさらに2回すすり続けてください。カバースリップ上の細胞が固定され、透過化されたので、インキュベーションが24ウェルプレートのウェル内で行われるべきであるという例外を除き、次の免疫組織化学の例で実証された染色手順に進みます。組織セクションスライドに直接ではなく。

開始するには、調製された、ホルマリン固定、パラフィン埋め込み組織セクションを得る。スライドラックに入れ、100%キシレンの250 mLに完全に浸漬することにより、スライドを脱パラフィン化します。スライドがキシレンで5分間インキュベートできるようにします。その後、容器からスライドを取り出し、ペーパータオルで拭き取り、さらに5分間新鮮な容器に入れ、新しいキシレン浴に入れます。

次に、100%エタノールから始まる一連のグレードのエタノール溶液でセクションを3分間水分補給する。ペーパータオルでスライドラックを拭き取り、スライドを100%エタノールの新しい容器に移し、さらに3分間使用します。この洗浄、ペーパータオルで乾燥し、指定された時間のエタノール濃度に従ってスライドを新しい浴場に移します。最終的なエタノール洗浄後、ペーパータオルでラックを拭き取り、内因性ペルオキシダーゼ活性を遮断するために、室温で30分間、100mLの過酸化水素を30分間インキュベートします。スライドを1X PBSの250mLで5分間洗います。新鮮な1X PBSの容器でこの洗浄をさらに5分間繰り返します。

次に、pH 6.0でIHCクレートバッファーの250 mLにスライドを浸漬し、それらを20分間沸騰させて抗原検索を行います。次に、染色プロトコルに進みます。

IHCの染色プロセスを開始するには、疎水性ペンでセクションを丸で囲み、バッファがカバーする必要がある最小限の領域を特定します。次いで、ピペットを使用して100マイクロリットルのブロッキングバッファーを配置し、この実験では1X PBSで希釈された馬血清をセクション上に置く。室温で1時間スライドをインキュベートします。この後、ピペットを使用してブロッキングバッファを削除します。

次に、1X PBSで希釈した990マイクロリットルの馬血清を1X PBSに添加して1:100希釈で一次抗体および遮断バッファーを希釈する。5 mLエッペンドルフチューブ、続いて一次抗体の10マイクロリットルが続く。希釈した一次抗体を各セクションに100マイクロリットルを加え、室温で30分間スライドをインキュベートする。タイマーが鳴ったら、各スライドから一次抗体を排出し、1X PBSの250 mLで5分間洗浄します。新鮮な1X PBSを使用して、もう一度この洗浄を繰り返します。

スライドが1X PBSで洗浄されている間、1.5 mLチューブに995マイクロリットルのブロッキングバッファーを加え、続いて5マイクロリットルの二次抗体(この場合はバイオチリン化された馬の抗マウスIGG)を加えることによって、二次抗体を1:200希釈に希釈する。希釈した二次抗体を各セクションに100マイクロリットルを加え、室温で30分間スライドをインキュベートする。30分後、セクションから排出して二次抗体を取り出し、1X PBSの250 mLで5分間洗浄します。新鮮な1X PBSを使用して、この洗浄を繰り返します。

さて、アビジンビオチン複合試薬の100マイクロリットルを追加し、室温で30分間暗闇の中でセクションをインキュベートします。次に、スライドを1X PBSの250 mLに5分間浸して洗います。以前の洗浄工程と同様に、新鮮な1X PBSを使用して、この洗浄をもう一度繰り返します。次に、DABの100マイクロリットルのセクションを最大5分間インキュベートしてスライドを開発します。250 mLの蒸留水に5分間浸漬して開発を中止します。

これで、必要に応じてスライドを逆染色できます。これを行うには、ハリスヘマトキシリン溶液の250 mLでスライドを簡単に浸します。250mLの蒸留水で5分間洗い流してカウンターステインを洗い流します。新鮮な蒸留水を使用して、この洗浄をもう1回繰り返します。次に、セクションを脱水します。これを行うには、まず95%エタノールでスライドを5分間インキュベートします。ペーパータオルの上にスライドをブロットし、さらに5分間新鮮な95%エタノールの新しい容器に移します。洗濯、ペーパータオルでブロッティング、スライドを新しいお風呂に移すサイクルを続け、それぞれ5分間の溶液に従います。

最終的なインキュベーションの後、ペーパータオルでスライドをブロットし、オルガノリモネンマウントなどの取り付けメディアのドロップをスライドに追加します。今、空気の泡をトラップしないように注意して、セクションの上にカバースリップを配置します。スライドは今分析のための顕微鏡の下で観察される準備ができている。

染色された部分を観察するには、標準的な光顕微鏡を使用して汚れを視覚化し、デジタルカメラを使用して画像をキャプチャします。IHCのこの特定の例では、野生型および自発性、二重トランスジェニック、またはDTGマウスからの脾臓組織が、リンパ腫におけるDyclin D1発現を研究するために比較される。組織をパラフィンを埋め込み、切除し、抗サイクリンD1抗体で染色し、20倍の倍率で画像化した。細胞を発現するサイクリンD1は、青色組織背景に対して赤褐色で示される。種々のマウスからの画像間の染色強度を比較すると、非拡大脾臓は、マウスの遺伝子型に関係なく、比較的低い量のCyclin D1発現を有する。これに対して、DTGマウスからの脾臓の肥大は、このマウスモデルにおける癌発症とCyclin D1発現との相関を示す赤褐色染色の増加を示す。

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