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Inmunohistoquímica e Inmunocitoquímica
 

Inmunohistoquímica e Inmunocitoquímica: Imágenes de tejidos a través de microscopía de luz

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La inmunocitoquímica y la inmunohistoquímica son métodos de tinción para una proteína de interés en las células y tejidos cultivados, respectivamente. El principio básico de ambas técnicas relacionadas implica el uso de anticuerpos específicos etiquetados con un sistema de detección para identificar y visualizar la proteína y determinar su ubicación dentro de las células y tejidos, así como los niveles relativos. El proceso en cualquiera de los experimentos comienza con la preparación de la muestra.

Para la inmunocitoquímica, que visualiza específicamente las ubicaciones de proteínas o antígenos en las células, esto implica tres pasos. El primer paso es el revestimiento, que implica el cultivo de las células en medios de crecimiento en un resbalón de cubierta o diapositiva, por lo general, en los pozos de una placa de cultivo. Esto es seguido por la fijación, donde un agente precipitante o reticulante como paraformaldehído se agrega a las células para preservar la integridad estructural de las proteínas y evitar que la actividad enzimática las degrade. El último paso es la permeabilización, que implica la adición de un detergente para hacer que las membranas celulares sean permeables para la tinción.

En el método homólogo, la inmunohistoquímica, las proteínas o los antígenos se visualizan en los tejidos y la preparación de la muestra tiene cinco pasos. En primer lugar, todo el tejido se somete a fijación, generalmente con paraformaldehído. Esto es seguido por la incrustación del tejido en un bloque de parafina, y luego la sección de este bloque usando una máquina llamada microtome para cortar el tejido en rodajas delgadas que se pueden colocar en diapositivas. A continuación, las diapositivas se someten a desparafinación, o eliminación de la parafina alrededor de la rebanada de tejido. A continuación, se puede realizar un paso opcional de recuperación de antígenos. Esto se puede hacer usando calor o enzimas para desenmascarar epítopos que fueron reticulados durante la fijación, haciéndolos disponibles para la unión de anticuerpos. Después de la preparación adecuada de la muestra, se agrega un anticuerpo primario específico del objetivo a la muestra de células o tejidos. Este anticuerpo primario debe unirse a la proteína de interés. A continuación, se añade un anticuerpo secundario, que detecta y se une al anticuerpo primario. Este anticuerpo secundario se conjuga con una enzima llamada HRP o puede unirse a ella. Cuando se añade su sustrato específico, DAB, HRP lo convierte en un precipitado marrón insoluble. Esta mancha marrón marca la ubicación de la proteína diana. Las diapositivas también están teñidas con hematoxilina, que etiqueta los núcleos en azul y proporciona un punto de referencia espacial para determinar la localización subcelular. Después de eso, el soporte de montaje se añade a la diapositiva, seguido de un deslizamiento de la cubierta con el fin de sellar y preservar la muestra manchada. Por último, las diapositivas se pueden crear imágenes en un microscopio de luz.

En este video, observará la técnica de preparación de muestras para células chapadas y secciones de tejido, seguida de inmunomanchación de las secciones de tejido.

En primer lugar, las células de interés deben sentarse en los labios de las cubiertas. Para ello, trabajando en una capucha de cultivo de tejido, coloque los cubredes individuales en los pozos de una placa de 24 pocillos. A continuación, cierre la faja y encienda la luz UV para esterilizar los labios de las cubiertas durante al menos 15 minutos. A continuación, apague la luz UV. Para levantar las células de interés de un plato de 10 centímetros confluente, aspirar el medio, lavar brevemente con PBS y agregar trippsina a las células durante 2 minutos. A continuación, toque el lado de la placa para asegurarse de que las células se han desprendido y neutralizar la trippsina con medios. A continuación, agregue 0. 5 ml de la suspensión celular en cada poca, asegurándose de cubrir los cubrecubiertas. Coloque la placa en una incubadora de CO2 humidificada y permita que las células crezcan a 37 grados centígrados hasta que sean de 50-70% de confluentes.

Una vez que las células alcanzan la confluencia óptima, aspirar el medio de cultivo de cada poca, y luego fijar las células incubando en . 5 ml de paraformaldehído 4% diluido en 1X PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de retirar el fijador, enjuague las células añadiendo 1 ml de 1X PBS sobre cada cubreobjetos. Aspirar inmediatamente el PBS, luego repetir el enjuague 2 veces más para un total de 3 lavados.

Ahora, permeablize las celdas agregando 0.5 mL de 0.1% Triton X-100 en 1X PBS a cada pozo. Deje el plato a temperatura ambiente durante 15 minutos. Aspirar fuera del búfer de permeabilización y luego enjuagar las células agregando 1 mL de 1X PBS en cada pozo. Aspirar inmediatamente el PBS y repetir el enjuague 2 veces más para un total de 3 lavados. Ahora que las células en los cubreobjetos están fijas y permeabilizadas, proceda al procedimiento de tinción demostrado para el siguiente ejemplo de inmunohistoquímica con la excepción de que las incubaciones deben realizarse dentro de los pocillos de la placa de 24 pocillos en lugar de directamente en una diapositiva de sección de tejido.

Para empezar, obtener secciones de tejido preparadas, fijas en formalina, incrustadas en parafina. Desparaffinizar las diapositivas colocándolas en un portaobjetos y luego sumergirlas por completo en 250 ml de 100% de xileno. Deje que las diapositivas se incuban durante 5 minutos en el xileno. A continuación, retire los portaobjetos del recipiente, límpielos con una toalla de papel y colóquelos en un nuevo baño de xileno en un recipiente nuevo durante otros 5 minutos.

A continuación, rehidrata las secciones de una serie de soluciones de etanol calificadas a partir del 100% de etanol durante 3 minutos. Limpie la portaobjetos con una toalla de papel y transfiera las diapositivas a un nuevo recipiente de etanol 100% durante otros 3 minutos. Continúe este ciclo de lavado, secado con una toalla de papel y transferencia de los portaobjetos a un nuevo baño siguiendo las concentraciones indicadas de etanol durante el tiempo especificado. Después del lavado final de etanol, limpie el estante con una toalla de papel e incubar los portaobjetos en 100 ml de peróxido de hidrógeno de .3% durante 30 minutos a temperatura ambiente para bloquear cualquier actividad endógena de peroxidasa. Lave los portaobjetos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Repita este lavado en un recipiente de 1X PBS fresco durante 5 minutos adicionales.

A continuación, realice la recuperación de antígenos sumergiendo las diapositivas en 250 ml del tampón de citrato IHC a pH 6.0 y hirviéndolas durante 20 minutos. Luego, proceda al protocolo de tinción.

Para comenzar el proceso de tinción para IHC, circule las secciones con una pluma hidrófoba para identificar el área mínima que el tampón necesita cubrir. A continuación, utilice una pipeta para colocar 100 microlitros de tampón de bloqueo, que en este experimento es suero de caballo diluido en 1X PBS, sobre la sección. Incubar los toboganes durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de esto, retire el búfer de bloqueo utilizando una pipeta.

A continuación, diluir el anticuerpo primario y el tampón de bloqueo en una dilución de 1:100 mediante la adición de 990 microlitros de suero de caballo diluido en 1X PBS en un 1. Tubo Eppendorf de 5 ml, seguido de 10 microlitros del anticuerpo primario. Añadir 100 microlitros del anticuerpo primario diluido a cada sección, e incubar los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando suene el temporizador, drene el anticuerpo primario de cada diapositiva y luego lávelo en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Repita este lavado una vez más usando 1X PBS fresco.

Mientras que los portaobjetos se lavan en 1X PBS, diluir el anticuerpo secundario a una dilución 1:200 mediante la adición de 995 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo de 1,5 ml seguido de 5 microlitros del anticuerpo secundario, que en este caso es biotinylated caballo anti-ratón IGG. Añadir 100 microlitros del anticuerpo secundario diluido a cada sección, y luego incubar los portaobjetos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, retire el anticuerpo secundario drenando las secciones, luego lave los portaobjetos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Repita este lavado con 1X PBS fresco.

Ahora, agregue 100 microlitros de reactivo complejo de avidina-biotina e incubar las secciones en la oscuridad durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, lave los portaobjetos sumergiéndolos en 250 ml de 1X PBS durante 5 minutos. Al igual que los pasos de lavado anteriores, repita este lavado una vez más con el PBS 1X fresco. A continuación, desarrollar las diapositivas mediante la incubación de las secciones en 100 microlitros de DAB durante un máximo de 5 minutos. Detenga el desarrollo sumergiendo las secciones en 250 ml de agua destilada durante 5 minutos.

Ahora, las diapositivas se pueden contraconservar, si se desea. Para ello, sumerja brevemente los portaobjetos en 250 ml de Harris Hematoxylin Solution. Enjuagar la contramancha lavando los portaobjetos en 250 ml de agua destilada durante 5 minutos. Repita este lavado 1 vez más con agua fresca destilada. A continuación, deshidratar las secciones. Para ello, primero incubar los toboganes en etanol al 95% durante 5 minutos. Soplar los portaobjetos en una toalla de papel, y transferirlos a un nuevo recipiente de etanol fresco 95% durante otros 5 minutos. Continúe el ciclo de lavado, hinchando con una toalla de papel y transfiriendo los portaobjetos a un baño nuevo, siguiendo las soluciones indicadas durante 5 minutos cada uno.

Después de la incubación final, separen las diapositivas con una toalla de papel y, a continuación, agregue una gota de soporte de montaje, como el monte Organo-Limoneno, a las diapositivas. Ahora, coloque un cubreobjetos sobre las secciones, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire. Las diapositivas ya están listas para ser observadas bajo un microscopio para su análisis.

Para observar las secciones manchadas, utilice un microscopio de luz estándar para visualizar la mancha y una cámara digital para capturar la imagen. En este ejemplo particular de IHC, los tejidos del bazo de tipo salvaje y espontáneos, dobletransgénicos o ratones DTG, se comparan para estudiar la expresión de Dyclin D1 en el linfoma. Los tejidos estaban incrustados en parafina, seccionados y teñidos con anticuerpo anticiclina D1, y se imagearon con aumento 20 veces. Las células expresións de la ciclina D1 están indicadas por el color marrón rojizo sobre el fondo del tejido azul. Comparando las intensidades de tinción entre las imágenes de los diversos ratones, los bazos no agrandados tienen cantidades relativamente bajas de expresión de Cyclin D1 independientemente del genotipo del ratón. Por el contrario, el bazo agrandado del ratón DTG, muestra un aumento de la tinción de color marrón rojizo que indica una correlación entre el desarrollo del cáncer y la expresión de Ciclina D1 en este modelo de ratón.

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