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Ensayo para la muerte celular: Ensayo de liberación de cromo de la capacidad citotóxica

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En este video observará cómo realizar el ensayo de liberación de cromo y determinar el potencial citotóxico de las células efectoras.

Las células inmunitarias son responsables de identificar y eliminar las células potencialmente dañinas, como el cáncer o las células infectadas por el virus, del cuerpo, que es una parte integral de la respuesta inmunitaria. Varias células inmunitarias, como las células T y las células NK, poseen una propiedad conocida como potencial citotóxico, que es la capacidad de identificar las células diana y secretar proteínas que inducen la degradación de las proteínas, la lisis y la muerte de esas células diana. Cuantificar el potencial citotóxico es fundamental para medir la activación y potencia de las células inmunitarias, y el ensayo de liberación de cromo se utiliza comúnmente para este propósito.

Este método permite a los usuarios comparar la toxicidad inducida por tipos específicos de células inmunitarias en diferentes condiciones, que es valioso para el estudio de la inmunoterapia contra el cáncer y enfermedades relacionadas con la inmunidad. Para empezar, las células diana, como las células cancerosas, se incuban con un isótopo radiactivo, cromo 51, que es tomado por las células. A continuación, estas células radioeléctricas etiquetadas se co-cultivan con las células inmunitarias aisladas de interés, también llamadas células efectoras, en un fondo redondo, placa de 96 pocillos para facilitar la interacción entre los dos tipos de células.

La configuración general del ensayo implica la incubación de un número específico de células diana con diferentes concentraciones de las células inmunitarias, junto con controles adecuados. El co-cultivo permite que las células efectoras induzcan apoptosis y lisis en las células diana, lo que resulta en la liberación del cromo intracelular 51 en el sobrenadante. Luego, en un momento preoptimizado, el sobrenadante que contiene el cromo liberado se cosecha de todos los pozos. El cromo 51, al ser radiactivo, sufre espontáneamente caries radiactivas para emitir radiación gamma. Los niveles de radiación gamma en los sobrenatantes de todos los pocillos de la placa de ensayo representan una salida cuantificable de la lisis de las células diana. Esto se mide utilizando un contador gamma, que luego se utiliza para determinar el potencial citotóxico de las células inmunitarias.

Para empezar, las células diana, la línea celular de melanoma humano WM793 en este ejemplo, se preparan en una suspensión de una sola célula. Para ello, primero retire los medios del matraz de cultivo de tejido y lave las células con cinco mililitros de 1X PBS. Decantar el PBS y luego añadir un mililitro de trippsina a la placa durante aproximadamente dos minutos. Toque suavemente el matraz para aflojar las células de la superficie del matraz y luego agregue cinco mililitros de medios RPMI al matraz. Pipetear el medio hacia arriba y hacia abajo para recoger las células y añadir esta suspensión a un tubo cónico de 15 mililitros.

Coloque el tubo en la centrífuga durante cinco minutos a 1200 RPM. A continuación, retire el medio del tubo asegurándose de no interrumpir el pellet celular. Mueva suavemente la parte inferior del tubo para interrumpir el pellet celular y agregue 10 mililitros de medios al tubo. Luego, pipetee suavemente el medio hacia arriba y hacia abajo para poner las células en suspensión. A continuación, determine la concentración celular utilizando un hemocitómetro y transfiera dos mililitros de la suspensión celular original a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros. Coloque el tubo en una centrífuga y gletee las células a 12cientos RPM durante cinco minutos. Después de la centrifugación, vierta el exceso de medios fuera del tubo en un contenedor de residuos. Brevemente vórtice el tubo para resuspender el pellet celular en el pequeño volumen de medio dejado atrás.

A continuación, prepárate para usar Chromium 51 moviéndote a un espacio de laboratorio dedicado a esta radiactividad en particular. Debe haber un amplio blindaje de plomo para el almacenamiento seguro y el uso del Cromo 51 durante todos los pasos, así como la señalización adecuada para indicar dónde se guardan las muestras con Cromo 51. Un contador Geiger equipado con una sonda de panqueque también es necesario para servir en el espacio para una posible contaminación.

Una vez configurado para el uso adecuado de la radiactividad, agregue 100 microcuries de cromo 51 directamente a la suspensión de la célula objetivo. Luego, agregue un pequeño trozo de cinta radiactiva al tubo para indicar que la muestra y el tubo ahora son radiactivos. Coloque el tubo en una incubadora de 37 grados celsius con un escudo de plomo e incubar durante una hora, moviendo el tubo cada 15 a 20 minutos.

Mientras las células diana están etiquetando, prepare una suspensión de una sola célula de las células efectora. En este ejemplo, las células mononucleares de sangre periférica humana, o PDMC, se aislaron de la sangre entera mediante centrifugación de gradiente de densidad estándar a una concentración de 5 veces 10 a 6o. Transfiera esta suspensión de células efectoras a un depósito de reactivo desechable y luego agregue 200 microlitros de esta suspensión en cada pozo de la fila B en una placa redonda de 96 pocillos. A continuación, agregue 100 microlitros de RPMI a cada pozo en la fila C a g de la placa.

Ahora, comience a realizar diluciones en serie de los PMIC para tener un rango de números de células efectoras eliminando primero 100 microlitros de las células en los pozos de la fila B y agregando esto a la fila C. Luego, diluir aún más las células efector transfiriendo 100 microlitros de células de la fila C a la fila D. Continúe la dilución en serie. Una vez alcanzada la fila G, mover 100 microlitros de los pozos para dejar un volumen final de 100 microlitros en cada pocal en esa fila. A continuación, agregue 100 microlitros de medio de cultivo de tejido a los pozos de la fila A para servir como control para la liberación espontánea de cromo 51 de las células diana, ya que no se deben agregar células efectoras a esta fila. Luego, coloque una placa en una incubadora de 37 grados celsius hasta que las celdas diana estén listas para ser agregadas.

Después del período de incubación, retire las células diana de la incubadora y lave con 5 mililitros de FBS para eliminar cualquier exceso de cromo 51. A continuación, coloque el tubo en una centrífuga designada y gire a 1200 rpm durante 5 minutos. Retire el lavado fbS radiactivo en un recipiente de residuos adecuado y repita el paso de lavado volviendo a cargar el pellet en un nuevo 5 mililitros de FBS. Coloque el tubo en una centrífuga designada y vuelva a girar las células a 1200 rpm durante 5 minutos. Retire el segundo lavado y compruebe si el pellet tiene radiactividad incorporada utilizando un contador Geiger. Finalmente, Resuspende el pellet en 10 mililitros de medio completo y vierta la suspensión de células de destino Chromium 51 en un depósito de reactivo satíuco. Luego, agregue 100 microlitros de estas células diana etiquetadas a cada pozo de la placa celular efectora de 96 pocillos. A continuación, agregue 100 microlitros de 1% NP-40 en agua a los pozos de la fila H para cargar todas las células objetivo esta cada fila. Estos pozos se utilizarán como un control para determinar los recuentos totales por minuto, o cpm.

Ahora que la placa está preparada, asegure la tapa añadiendo un pequeño trozo de cinta adhesiva a cada lado de la placa y coloque un trozo de cinta radiactiva en la tapa para indicar que contiene cromo 51. A continuación, coloque la placa en una centrífuga marcada para manipular muestras radiactivas. Si sólo se utiliza una placa experimental, agregue una placa de equilibrio a la centrífuga. Ajuste la centrífuga a 1200 rpm y ponga la placa al día. Una vez a la velocidad, detenga la máquina. Retire la placa de la centrífuga. A continuación, coloque la placa en una incubadora de 37 grados celsius con un pequeño trozo de blindaje de plomo sobre la placa para mayor seguridad. Incubar durante 16 horas para permitir que las células diana se disparen.

Al final del período de incubación, retire cuidadosamente la cinta alrededor del borde de la placa y retire la tapa. A continuación, coloque el marco de cosecha en la placa asegurándose de confirmar que los pequeños discos de filtro están en su lugar para cada uno de los tapones de algodón. Ahora, presione lentamente y suavemente los tapones de algodón en los pozos. Después de aproximadamente diez segundos, suelte la presión sobre los tapones de algodón y, a continuación, transfiera los tapones de algodón a las tiras de tubo. Coloque cada uno de estos tubos en un tubo FACS secundario. Finalmente, cargue los tubos FACS en un contador gamma y ejecute las muestras para cuantificar la cantidad de cromo 51 liberado en cada condición. Registre cuidadosamente el orden en que se cargaron los tubos en el mostrador.

Aquí, los PPC no estimulados se añadieron a los primeros 3 carriles y los PMBC estimulados por CPG se añadieron a los carriles 4 a 6. En este ejemplo, los recuentos por minuto se introdujeron en las celdas de una hoja de cálculo de la misma manera que las muestras se colocaron en la placa original y se calcularon los promedios de los triplicados. Por ejemplo, para la primera condición, las celdas A1, A2 y A3 se promediaron en la celda I3. Una vez determinados los promedios, el porcentaje de lisis específica para cada condición se puede calcular utilizando esta fórmula. Por ejemplo, para calcular la lisis específica porcentual para las células no estimuladas que tenían una relación de 50 a 1 células efectoras para las células diana, el CPM espontáneo, que en este ejemplo, es 1164.67, se restó del CPM experimental, 1129. 67. Este número puede dividirse por la diferencia entre el CPM máximo y el CPM espontáneo, y luego multiplicarse por 100 para dar el porcentaje de lisis específica. A continuación, se calcula para cada condición. Estos datos se pueden graficar para mostrar la comparación de la relación E a T con el porcentaje de lisis específica para los PPC no estimulados, y los PPC estimulados por CPG. En este ejemplo, las células efectoras estimuladas con CPG mataron más eficazmente las células diana a medida que aumentaba la proporción de células efectoras con las células objetivo. Este aumento no se observó en los PRAM no estimulados, lo que indica que la estimulación de CPG es necesaria para el aumento observado de la lisis de células diana.

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