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Diluciones en serie y chapado: enumeración microbiana

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A veces, con el fin de identificar y estudiar las bacterias primero necesitamos aislarlas y enriquecerlas de una muestra. Por ejemplo, las muestras obtenidas de una columna de Winogradsky son mixtas, lo que significa que contienen múltiples especies o cepas de bacterias, por lo que estudiar una bacteria individual o enumerar los diferentes tipos presentes puede ser un reto. Con este fin, las técnicas de dilución en serie y chapado se emplean típicamente para cuantificar de forma fiable la carga bacteriana y aislar colonias individuales.

La dilución en serie es un proceso a través del cual la concentración de un organismo, bacterias en este ejemplo, se reduce sistemáticamente a través de la resuspensión sucesiva en volúmenes fijos de diluyente líquido. Por lo general, el volumen del diluyente es un múltiplo de 10 para facilitar la reducción logarítmica del organismo de la muestra. Por ejemplo, un gramo de sedimento se elimina primero de la zona de Winogradsky de interés y se añade a 10 mililitros de un medio líquido adecuado. Luego, un mililitro de esta primera dilución se añade a otro tubo que contiene nueve mililitros de medio. El proceso se puede repetir hasta que se hayan preparado varias concentraciones diferentes de bacterias. La dilución en serie es la clave para la enumeración de bacterias en este ejemplo, ya que las muestras mixtas de una columna Winogradsky contienen un número desconocido, a menudo grande, de bacterias.

A continuación, el revestimiento de rayas y el recubrimiento extendido permiten el aislamiento y la enumeración de bacterias dentro de una muestra, respectivamente. El rayado se logra introduciendo una muestra diluida en una sección del medio sólido complementado con nutrientes, que se divide en tercios. Este inóculo se extiende sobre cada tercio de la placa en un patrón en zig-zag. A medida que las diferentes secciones de la placa están rayadas, cruzando de la muestra anterior sólo una vez, la muestra se extiende más delgadamente. Esto significa que es posible que solo necesite rayar una dilución para lograr colonias individuales en las secciones posteriores. Después de la incubación, las placas rayadas permiten observaciones de la morfología de la colonia, información que puede ayudar a diferenciar entre diferentes especies bacterianas.

Alternativamente, si el objetivo principal es la enumeración de las bacterias en el revestimiento de propagación de la muestra se puede utilizar. En el recubrimiento extendido, una alícuota de una sola muestra se extiende uniformemente sobre toda la superficie del medio sólido. Típicamente, debido a que no sabemos los números bacterianos en la muestra mixta, se hace una placa de propagación para cada una de las diluciones o una muestra representativa de ellos. Después de la incubación, la enumeración se puede realizar utilizando estas placas de propagación. Cualquier placa con recuentode de colonias menos de 30 debe ser descartada, ya que los recuentos pequeños están sujetos a un error mayor. Del mismo modo, cualquier recuento de más de 300 debe descartarse porque el hacinamiento de las colonias y la superposición pueden conducir a la subestimación del recuento de colonias. Si el recuento de colonias de cada uno de estos platos restantes se registra y se multiplica por el factor de dilución, y luego se divide por el volumen chapado, esto produce las unidades formadoras de colonias, o UFC, por mililitro de suspensión. En este video, aprenderá cómo evaluar cualitativa y cuantitativamente una muestra que contiene una bacteria conocida, y las comunidades microbianas contenidas en varias regiones de una columna Winogradsky a través de dilución en serie, revestimiento extendido y revestimiento de rayas.

En primer lugar, ponte cualquier equipo de protección personal apropiado, incluyendo un abrigo de laboratorio, guantes y gafas. A continuación, esterilizar el espacio de trabajo con 70% de etanol y limpiar la superficie. A continuación, recoger dos frascos Erlenmeyer de 500 mililitros y etiquetar un caldo y el otro agar. Para preparar la solución de agar LB, mezcle aproximadamente 6,25 gramos de agar LB, tres gramos de agar técnico y 250 mililitros de agua destilada en el agar etiquetado con etiqueta.

A continuación, prepare el caldo LB combinando 2. 5 gramos de medios LB y 100 mililitros de agua destilada en el caldo etiquetado con matraz. Después de autoclave de los matraces, utilice un guante resistente al calor para eliminar los matraces del autoclave y colóquelos en un baño de agua celsius de 40 a 50 grados. Una vez que los matraces estén a 50 grados centígrados, prepare cuidadosamente tres alícuotas de 100 mililitros de la solución de caldo y etiquete cada solución alícuota cero. A continuación, reúna 10 platos de petri estériles y etiquételos con la fecha, el nombre, el tipo de medio utilizado y la zona de la columna Winogradsky de la que se cosecharán los organismos. Pipetear 15 mililitros de agar del matraz de agar en cada plato de petri. A continuación, utilice la punta de la pipeta para eliminar las burbujas, reemplazar las tapas de las placas y dejar que se solidifiquen en la parte superior del banco durante la noche.

Al día siguiente, limpie la parte superior del banco con 70% de etanol. A continuación, etiquete 10 tubos de ensayo de 20 mililitros T1 a T10 y colóquelos en un bastidor. Pipetear nueve mililitros de solución salina de .45% en cada tubo. Ahora, cubra cada uno de los 10 tubos de ensayo libremente con sus tapas y transfieralos a un bastidor de tubo de ensayo compatible con autoclave. Una vez completado el ciclo, retire los espacios en blanco de salina con guantes resistentes al calor y déjelos enfriar. Almacene los tubos a temperatura ambiente hasta que hayan alcanzado aproximadamente 22 grados centígrados.

Para cultivar un organismo objetivo conocido, E. coli en este ejemplo, inocular 100 mililitros de solución cero con una sola colonia de una placa previamente rayada. Luego, cubre el tubo e incuba rindelo durante la noche a 37 grados centígrados. Para evaluar las regiones de una columna Winogradsky, agregue aproximadamente un gramo de material de la zona aeróbica a T1 y resuspenda por vórtice. A continuación, repita este proceso con un gramo de material de la zona anaeróbica.

Retire el tubo que contiene la solución cero inoculada con E. coli de la incubadora y agítela. A continuación, pipetear un mililitro de la solución en un tubo de ensayo T1 y vórtice para mezclar. Retire un mililitro de solución de T1 y transfiéralo a T2, vórtice para mezclar. Repita este proceso a través del tubo T10. Para evaluar las zonas aeróbicas y anaeróbicas de la columna Winogradsky, retire un mililitro de solución de cada uno de los tubos T1 previamente preparados y transfiéralo a los tubos T2 apropiados. A continuación, continúe las diluciones en serie a través de los tubos T10 como se demostró anteriormente.

Para esparcir la placa, pipeta 100 microlitros de la muestra diluida de cada tubo T3 en la placa petri correspondiente. A continuación, utilice una varilla de esparcimiento estéril para distribuir suavemente la muestra en la placa de petri y reemplazar la tapa de la placa. Repita este proceso para las diluciones T6 y T9, como se ha demostrado anteriormente. Incubar las placas que contienen organismos aeróbicos en una incubadora de 37 grados Celsius durante 24 horas. Incubar las placas que contienen organismos anaeróbicos en una cámara anaeróbica establecida en 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente retire las placas de dilución T3, T6 y T9 de la incubadora y la cámara anaeróbica y transfieralas a la parte superior del banco. Trabajando con una placa a la vez, deslice un bucle inoculante estéril a través de la parte superior del medio en un patrón en zig-zag. A continuación, sustituya la tapa de la placa de petri. A continuación, gire la placa por 1/3 y esterilizar el bucle para reducir la frecuencia del patrón en zig-zag previamente hecho. Una vez más, después de esterilizar el lazo, gire la placa por 1/3, reduzca la frecuencia del patrón en zig-zag una última vez y reemplace la tapa. Repita este método de rayado para las placas restantes, como se ha mostrado anteriormente. A continuación, coloque las placas rayadas que contienen organismos aeróbicos en una incubadora de 37 grados Celsius durante la noche y las placas rayadas que contienen organismos anaeróbicos en una cámara anaeróbica establecida en 37 grados centígrados durante la noche.

Los cultivos fueron cosechados de las zonas aeróbicas y anaeróbicas de una columna Winogradsky de siete días. Luego, los cultivos se diluyeron en serie antes de rayar y extenderse en placas de agar LB. El rayado reveló una población mixta de cada una de las zonas evaluadas de Winogradsky, y las placas de propagación produjeron resultados similares. Un plato rayado de una población mixta dará lugar a colonias bacterianas de diferentes formas, tamaños, texturas y colores. Por el contrario, las placas rayadas y esparcidas que contienen el organismo conocido, E. coli, demostraron una población homóloga. Generalmente, es mejor calcular las UFC por mililitro utilizando el recuento medio de colonias de tres placas repartidas con la misma muestra y factor de dilución. Multiplique el número medio de colonias por el factor de dilución y divida por la cantidad alícuota. Por último, las colonias aisladas elegidas de cada placa se pueden utilizar en ensayos de enriquecimiento adicionales para determinar la identidad de las especies.

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