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纯培养和条纹电镀:从混合样品中分离单一细菌菌落
 

纯培养和条纹电镀:从混合样品中分离单一细菌菌落

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在培养皿中,如果一种细菌经历多轮无性繁殖,将导致克隆菌群的形成。然而,从混合样品(如土壤悬浮液)获得单个细菌可能很困难。如果这种异质文化被一循环地接受,它可以包含多达一万亿个单个细菌。为了将这么多细菌传播到琼脂板的表面,获得单个菌落,即使使用锯齿形图案,循环也需要连续拖动到足够多的板块的表面并排设置,以包围整个自由岛。显然,科学家并没有真正使用那么多的盘子。相反,他们使用一种称为条纹电镀的技术。

条纹板技术基于细菌样品的逐行稀释,并在单个培养皿的固体介质表面执行。首先,介质表面在视觉上分为五个部分,将圆周的四个片段指定为前四个部分,将板块的中心作为第五个部分。这将有效地创建五个媒体板出一个单一的培养皿。接下来,使用所需的接种循环,使用锯齿形图案对第一部分进行条纹。然后,要么使用新的一次性环路,或者在电线环路的情况下,它用Bunsen燃烧器消毒,燃烧,直到它沿电线的长度红热。这种使用新的循环,或火焰灭菌循环,去除任何剩余的细菌细胞,帮助稀释细菌。然后,热循环在空气中冷却几秒钟,然后被拖过第一部分,形成三到四条单独的线,每条线只携带一小部分细菌进入第二部分。其余部分以相同的方式条纹,每次使用无菌循环,并穿过前一条条纹。

使用这种条纹和消毒循环,应稀释后续部分的细菌浓度,以便最后部分仅包含几个离散定位的细菌。孵化后,这些离散细菌繁殖产生亚细胞的分离克隆菌落,称为菌落形成单位,或CFU。这些可以收获和重新采摘,以确保后续工作只涉及一种细菌类型,称为纯培养物。除了将单菌落从混合细菌培养物中分离外,条纹电镀技术还用于选择介质特异性菌株、确定细菌菌群形态或识别不同的细菌种类。在本视频中,我们将演示如何通过条纹电镀技术从混合细菌样品悬浮液中分离出单细菌菌落。

首先,戴上实验室手套和实验室外套。接下来,使用 70% 乙醇对工作空间进行消毒。接下来,选择一个合适的介质,以维持被利用的细菌物种或菌株,并开始准备培养物。在这里,常见的LB琼脂是通过称出10克预配方,粉末介质和7.5克琼脂。将称重、干燥的组件添加到玻璃瓶中,该玻璃瓶可容纳两倍的最终体积,以避免溢出。然后,在瓶子里加入500毫升的水,然后半紧闭盖上。将瓶子放入摄氏121度的高压灭菌器中,进行20分钟的消毒。完成后,使用防热手套或热垫从机器上取下介质,然后立即拧紧瓶盖将其紧紧合住。

对于当天使用,让介质冷却,将瓶子放入加热到约 45 摄氏度的水浴中,以保持介质处于液态状态。或者,介质可以在室温下储存在固态状态下。必要时,用盖子稍微打开的瓶子微波以熔化介质,并使用 45 摄氏度的水浴让介质冷却。

接下来,拿一套无菌培养皿,并带有永久标记,用调查员和媒体名称以及日期标记。然后,将所需的介质体积转移到无菌容器中,并在必要时添加抗生素或其他敏感成分。在这里,50毫升的介质与100微升的卡那霉素混合,最终浓度为每毫升25微克。旋转管,以确保在整个介质中均匀分布添加的部件。慢慢地,为了避免气泡形成,将20至25毫升约45摄氏度的培养介质倒入每个板中。如果出现气泡或泡沫,请使用常规移液器和无菌尖端快速清除。然后,立即更换所有盖子以防止污染。让琼脂在室温下凝固至少两小时或过夜。凝固后,将培养板倒置在四摄氏度,以尽量减少介质表面的冷凝。

要条纹文化选择,首先采取一个干净的文化板,并删除盖子。快速工作,将一次性无菌循环浸入所需的接种中,然后立即使用锯齿形运动将环拭过板的第一象限。更换盘子的盖子,丢弃用过的接种回路,然后选择一个新的无菌循环。使用新的循环,使三到四个笔画跨越从第一象限辐射的原始拭子线,该象限应包含相对密集的细菌群进入第二象限。再次关闭盖子,并丢弃循环。使用新循环时,再次重复此操作,但这次从第二个象限进入第三个象限。然后,再次使用新的循环,从第三段进入第四节。最后,使用新的循环,以锯齿形图案从第四象限向板中心进行最后一个描边。这一地区的细菌患病率将较低,理想情况下允许从单个活的母细胞建立单个菌落。

更换板盖,如果适合细菌种类,用底片密封板,以防止气流。将培养板倒置,以防止冷凝滴,然后放置在适当的温度进行生长。在这里,一个孵化器被设置为37摄氏度。让板孵育,直到细菌菌落可见。要生成克隆细菌群,请从该板块中选择一个离散菌群。现在,用无菌循环,触摸目标菌落,和以前一样,在新板的第一象限中发出条纹。继续交替消毒循环,并条纹板的剩余象限,如前所述,以锯齿形到中心结束。关闭板,并将其放置以孵育,直到离散菌落形成。一旦这些菌落生长,它们通常代表纯克隆菌株。

初始条纹板可能含有来自不同细菌物种的细胞或具有不同遗传成分的细胞的菌落,具体取决于样品纯度。通过随后分离单个菌落,其中所有单位都派生自一个共同的母细胞,第二条纹程序产生相对克隆的细菌群,适合进一步表征或接种到肉汤。

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