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Cultures pures et platage de strie : isolement des colonies bactériennes simples d'un échantillon mélangé

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Sur un plat Petri, si une bactérie unique subit plusieurs cycles de reproduction asexuée, elle conduira à la formation d'une colonie clonale. Cependant, il peut être difficile d'obtenir une seule bactérie à partir d'un échantillon mixte, comme une suspension du sol. Si l'on en boucle de cette culture hétérogène est prise, il peut contenir jusqu'à un billion de bactéries individuelles. Pour répandre autant de bactéries sur la surface d'une plaque d'agar et obtenir une seule colonie, même en utilisant un motif en zigzag, la boucle devrait être traîné en permanence sur la surface de suffisamment de plaques fixées côte à côte pour encercler l'ensemble de Liberty Island. De toute évidence, les scientifiques n'utilisent pas vraiment autant de plaques. Au lieu de cela, ils utilisent une technique appelée stries de placage.

La technique de la plaque de stries est basée sur la dilution progressive d'un échantillon bactérien, et elle est réalisée sur la surface média solide d'un seul plat Petri. Pour commencer, la surface du média est visuellement divisée en cinq sections en attribuant quatre fragments de la circonférence comme les quatre premières sections, et le centre de la plaque comme le cinquième. Cela permettra de créer efficacement cinq plaques de presse à partir d'un seul plat Petri. Ensuite, à l'aide d'une boucle d'inoculum désiré, la première section est strié à l'aide d'un motif en zig-zag. Ensuite, soit une nouvelle boucle jetable est utilisée, soit dans le cas d'une boucle métallique, elle est stérilisée à l'effile d'un brûleur Bunsen, le flamboyant jusqu'à ce qu'il soit rouge chaud le long de la longueur du fil. Cette utilisation d'une nouvelle boucle, ou boucle de stérilisation des flammes, élimine toutes les cellules bactériennes restantes, aidant à la dilution des bactéries. La boucle chaude est ensuite refroidie dans l'air pendant quelques secondes avant d'être traîné à travers la première section pour créer trois à quatre lignes distinctes, chacune ne transportant qu'une fraction de bactéries dans la deuxième section. Les sections restantes sont striées de la même manière, à l'aide d'une boucle stérile à chaque fois, et un seul passage à travers la série précédente.

En utilisant ce cycle de stries et de stérilisation, la concentration bactérienne dans chaque section suivante doit être diluée de sorte que la section finale ne contient que quelques bactéries discrètement localisées. Lors de l'incubation, ces bactéries discrètes se multiplient pour produire des colonies clonales isolées de cellules filles, appelées unités de formation de colonies, ou UFC. Ceux-ci peuvent être récoltés et re-streaked pour s'assurer que les travaux ultérieurs impliquent seulement un seul type bactérien, désigné sous le premier mot comme une culture pure. En plus d'isoler les colonies individuelles d'une culture mixte bactérienne, la technique de placage est également utilisée pour sélectionner des souches spécifiques aux médias, déterminer la morphologie des colonies bactériennes ou identifier différentes espèces bactériennes. Dans cette vidéo, nous allons démontrer comment isoler les colonies unibactériennes d'une suspension d'échantillon mixte-bactérienne par l'intermédiaire de la technique de placage de stries.

Pour commencer, mettez des gants de laboratoire et une blouse de laboratoire. Ensuite, stériliser l'espace de travail à l'aide de 70% d'éthanol. Ensuite, sélectionnez un milieu approprié qui soutiendra l'espèce ou la souche bactérienne utilisée et commencera à préparer les milieuis. Ici, l'agar commun de LB est préparé en pesant dehors dix grammes de pré-formulé, le support en poudre et 7.5 grammes d'agar. Ajouter les composants pesés et séchés à une bouteille en verre qui est capable de tenir deux fois le volume final pour éviter le débordement. Ensuite, ajoutez 500 millilitres d'eau à la bouteille, et le bouchon semi-serré. Stériliser les médias en plaçant la bouteille dans un autoclave réglé à 121 degrés Celsius pendant vingt minutes. Après l'achèvement, utilisez des gants anti-chaleur ou un coussin chaud pour enlever le support de la machine, puis tordez immédiatement le bouchon de la bouteille pour le fermer hermétiquement.

Pour l'utilisation le jour même, laissez les médias refroidir en plaçant la bouteille dans un bain d'eau chauffé à environ 45 degrés Celsius, pour préserver les médias dans un état liquide. Alternativement, le support peut être laissé à la température ambiante pour stocker à l'état solide. Au besoin, micro-ondes la bouteille avec le couvercle légèrement ouvert pour faire fondre le support, et laisser refroidir le média à l'aide d'un bain d'eau de 45 degrés Celsius.

Ensuite, prenez une manche de plats stériles Petri, et avec un marqueur permanent, les étiqueter avec l'enquêteur et les noms des médias ainsi que la date. Ensuite, transférez le volume requis de la presse dans un récipient stérile, et ajoutez des antibiotiques ou d'autres composants sensibles si nécessaire. Ici, 50 millilitres de médias sont mélangés avec 100 microlitres de Kanamycine pour une concentration finale de 25 microgrammes par millilitre. Faites tourbillonner le tube pour assurer une distribution uniforme des composants ajoutés dans tout le support. Lentement, afin d'éviter la formation de bulles, versez 20 à 25 millilitres d'environ 45 degrés Celsius milieu de culture dans chacune des plaques. Si des bulles ou de la mousse apparaissent, retirez-les rapidement à l'aide d'une pipette régulière et d'une pointe stérile. Ensuite, remplacez immédiatement tous les couvercles pour éviter la contamination. Laisser l'agar se solidifier à température ambiante pendant au moins deux heures ou toute la nuit. Une fois solidifiées, entreposez les plaques de culture à l'envers à quatre degrés Celsius pour minimiser la condensation à la surface du milieu.

Pour strier la culture de choix, prenez d'abord une plaque de culture propre et retirez le couvercle. En travaillant rapidement, immerger une boucle stérile jetable dans l'inoculum désiré, puis immédiatement écouvilloner la boucle sur le premier quadrant de la plaque à l'aide d'un mouvement en zigzag. Remplacez le couvercle du plat, jetez la boucle d'inoculation utilisée, puis sélectionnez une nouvelle boucle stérile. À l'aide de la nouvelle boucle, faire trois à quatre coups en traversant la ligne d'écouvillon d'origine rayonnant du premier quadrant, qui devrait contenir une population de bactéries relativement dense dans le deuxième quadrant. Fermez le couvercle une fois de plus, et jetez la boucle. Avec une nouvelle boucle, répétez cette action à nouveau, mais cette fois stries de la seconde dans le troisième quadrant. Puis, avec une nouvelle boucle à nouveau, faire une autre série de la troisième dans la quatrième section de la plaque. Enfin, avec une boucle fraîche, faire un dernier coup dans un modèle en zig-zag à partir du quatrième quadrant vers le centre de la plaque. La prévalence bactérienne sera plus faible dans cette région, ce qui permettra idéalement d'établir des colonies individuelles à partir d'une seule cellule mère viable.

Remplacer le couvercle de la plaque et, le cas échéant, sceller la plaque avec du film para pour empêcher l'écoulement de l'air. Tournez la plaque de culture à l'envers pour éviter les gouttes de condensation, puis placez-la à une température propice à la croissance. Ici, un incubateur est réglé à 37 degrés Celsius. Laisser la plaque incuber jusqu'à ce que les colonies bactériennes soient visibles. Pour générer une population bactérienne clonale, sélectionnez une colonie discrète à partir de cette plaque. Maintenant, avec la boucle stérile, touchez la colonie cible, et comme avant, faites une strie dans le premier quadrant d'une nouvelle plaque. Continuer à stériliser alternativement la boucle et strie les quadrants restants de la plaque comme précédemment démontré, se terminant par le zig-zag au centre. Fermez l'assiette et placez-la pour l'incuber jusqu'à formation de colonies discrètes. Une fois que ces colonies sont cultivées, elles représentent généralement de pures souches clonales.

La plaque de stries initiales peut contenir des colonies provenant de cellules de différentes espèces bactériennes ou cellules ayant une composition génétique différente, selon la pureté de l'échantillon. Par l'isolement ultérieur d'une seule colonie, où toutes les unités sont dérivées d'une cellule mère commune, la deuxième procédure de stries génère une population bactérienne relativement clonale, appropriée pour une caractérisation ou une inoculation plus poussée dans le bouillon.

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