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プラークアッセイ:プラーク形成単位(PFU)としてウイルス定数を決定する方法

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ファルジとも呼ばれるバクテリオファージは、細菌に特異的に感染するウイルスであり、プラークアッセイと呼ばれるツールを使用してその存在を確認し、定量化することができます。バクテリオファージは、まず細菌細胞壁に付着し、その遺伝物質を注入することによって、その感受性宿主に感染する。その後、細胞の生合成機械を乗っ取ってDNAを複製し、多数の子孫ファージ粒子を産生し、宿主細胞を分解して死傷させる。

この溶解活性は、プラークアッセイまたは二重寒天層アッセイとして知られている広く使用されているファージ列挙技術の基礎である。ここで、バクテリオファージミックスは、まず低濃度寒天を含む溶融栄養スープで調製される。ミックスで使用されるすべての細菌は生きていて、積極的にその成長のログ段階で分割する必要があり、細菌の大部分が生存し、プラークの周りに密な芝生を形成できることを保証します。次に、この溶融細菌ファージ寒天ミックスは、ペトリ皿上で既に固化されている、より固体、濃縮寒天栄養培地の上に広がります。室温でのインキュベーションでは、低濃度の寒天菌のスープも固化し、柔らかい寒天のオーバーレイを形成します。

ここでは、細菌細胞は、底層から追加の栄養素を導き出ることができ、細菌のコンフルエント芝生を生成するために急速に増殖する必要があります。しかし、ファージ粒子も軟層に存在するにつれて、これらは細菌内で遺伝物質に感染して複製し、細胞リシスに至り、複数の子孫を放出する。これらのファージ子孫は、細菌ファージ層の半固体状態がより遠くに位置する宿主細胞にその動きを制限するように、隣接する細胞に感染する。感染とリシスのこのサイクルは、複数のラウンドにわたって継続し、局所的な領域で多数の細菌を殺します。破壊される隣接細胞の効果は、肉眼で見ることができるプラークと呼ばれる単一の円形クリアゾーンを生成し、効果的にファージの細菌の溶解活性を増幅し、その列挙を可能にすることです。

ペトリ皿上のプラークの数は、プラーク形成単位、またはPfUと呼ばれ、かつ、初期バクテリオファージ濃度を十分に希釈した場合、元の試料中の感染性ファージ粒子の数に直接対応する必要があります。この技術は、プラーク形態の特性形成、ファージ型の同定に役立つ、またはファージ変異体を単離するためにも使用することができる。このラボでは、大腸菌のT7ファージを例に、ファージを列挙するためのプラークアッセイを実行する方法を学びます。

まず、宿主細菌細胞およびバクテリオファージの培養に適した培地を同定する。ここでリソジェニーブロス、またはLB培地は、大腸菌およびT7ファージを培養するために用いた。次に、3本のきれいなガラス瓶を取り、メディア、名前、次にLB-Broth、2つ目はLB-Bottom寒天、3本目はLB-Top寒天としてラベルを付けます。さて、あらかじめ配合されたLB粉末を4グラムずつ計量し、1セットの計量乾燥培ったメディアを各ボトルに移します。最初のボトルに200ミリリットルの水を追加します。磁気攪拌バーを使用して内容物を混ぜます。

次に、pHメーターと一定撹拌を用いて、水酸化ナトリウムまたは塩酸を添加することにより、最終的なpHを7.4にする。残りの2本のボトルについても、水の添加とpH調整を繰り返します。今、寒天粉末の3グラムの重量を量り、1.5%の底寒天を作るために2番目のボトルにそれを追加します。最後に、重量を量る 1.寒天の2グラムと.6%LBトップ寒天を作るために3番目のボトルにそれを追加します。ボトル1のスープの状態は寒天の添加を必要としません。ボトルを半き締めし、その後、20分間摂氏121度でオートクレーブによってメディアを殺菌します。完了したら、オートクレーブからメディアボトルを取り外し、すぐにボトルキャップをひねり、汚染を防ぐために完全に閉じます。LB-ブロスとLB-トップ寒天メディアをベンチに置いて、後で使用してください。LBボトム寒天を置き、約45°Cにあらかじめ設定された水浴で冷却します。

LB-Bottom 寒天が約45°Cに達したら、作業台に移します。次に、70%のエテノールを使用してワークスペースを殺菌します。次に、溶融底寒天に無菌1モル塩化カルシウムの450マイクロリットルを加え、最終的な濃度を2.25ミリモルにする。ボトルをそっと旋回して混ぜます。その後、7つのきれいなペトリ皿を設定します。下部の各料理に、メディア名と準備日にラベルを付けます。その後、底寒天の15ミリリットルを7つのペトリ皿のそれぞれに注ぎます。プレートを室温で数時間または一晩設定できるようにします。一度設定すると、培養プレートは、結露を最小限に抑えるために、必要に応じて数日間、4°Cで保存することができます。ペトリ皿を摂氏4度の冷蔵庫から37°Cのインキュベーターに1時間前に移します。

アッセイが事前に形成される前日には、大腸菌を培養する必要があります。ここで、大腸菌培養の10マイクロリットルをLB-ブロスの10ミリリットルに接種した。160 RPMで摂氏37度に設定された揺さぶるインキュベーターで一晩成長する細菌を置きます。次いで、アッセイの日に、インキュベーターから細菌培養を除去する。一晩培養の0.5ミリリットルで新鮮なLBスープの新鮮な10ミリリットルをシード。これらの細胞を160 RPMで摂氏37度に設定した揺れインキュベーターに成長させるために置きます。次に、分光光度計を使用して、このカルチャが対数相の成長に達した場合、0.5 ~ 0.7 の光学密度で示されます。ODがこのレベルに達したら、細胞培養をベンチに移すことによってインキュベーションを停止する。ファージオーバーレイアッセイに使用する準備が整いました。

ファージ価量は、異なるファージタイプとサンプルによって指数関数的に変化する可能性があります。したがって、それらを効果的に数えるために、彼らはファージ濃度の広い範囲を生成するために希釈する必要があります。アッセイの日に、10倍の希釈技術に従って、10分の1から100万分の1の濃度に及ぶ一連のファージ希釈を生成する。統計的に有意で正確なデータを取得するには、三逆でシリアル希釈を実行します。

次に、固化したLB-top寒天を電子レンジで溶かす。その後、1時間45°Cにあらかじめ設定された水浴に入れます。1時間後、インキュベーターから下部寒天層を含むペトリ皿を収集します。ファージ濃度とアッセイ日付でプレートにラベルを付けます。次に、7本のクリーン試験管を設置する。各試験管にシリアルファージ希釈番号をラベル付けし、1つをコントロールとして指定します。

LBトップ寒天が摂氏45度に達したら、作業ベンチに移します。さて、200ミリリットル寒天に塩化モルカルシウム1本の450マイクロリットルを加え、最終的な濃度を2.25ミリモルにします。ボトルをそっと旋回して混ぜます。次に、LBトップ寒天の35ミリリットルと無菌円錐管に細菌懸濁液の4ミリリットルを追加します。細胞を均等に分配するために穏やかに旋回するが、発泡を防ぐために揺れを避ける。

さて、この細菌のアリコート5ミリリットル- トップ寒天ミックス7つの試験管のそれぞれに。次に、連続的に希釈されたバクテリオファージサンプルおよびコントロールメディアの100マイクロリットルを、バクテリオファージを含む単に培地であるべきである、丁重に標識された試験管に移す。適切な混合を確実にするために、混合物を穏やかに旋回します。5ミリリットルのバクテリオファージミックスをそれぞれのペトリプレートにゆっくりと移します。ペトリプレートをそっと旋回して、表面全体に均等にミックスを広げます。

すべてのペトリプレートをミックスで重ねたら、室温で15分間インキュベートしてトップ層の固化を可能にする。これらのステップが完了した後、ファージ希釈の残りの2セットを使用して、ペトリ皿の第2と第3セットのプロセスを繰り返します。各皿をパラフィルムで密封し、室温で15分間インキュベートします。培養プレートを適切な温度で24時間、またはプラークが発達するまで逆さまに置きます。ここで、プレートを1日37°Cのインキュベーターに入れ、大腸菌及びT7ファージに対する刺激的な成長条件を有する。

プラークは、細菌種、インキュベーション条件、および培地の選択に応じて、インキュベーションの1〜5日後に現れる。ここでは、37°Cのインキュベーションの1日後にプラークが見えました。まず、マークされたコントロールのプレートをチェックし、ウイルス汚染を示すので、これらのプレートにプラークが形成されていないことを確認します。元のサンプルのファージ係数を決定するには、最初に最も希釈されたファージサンプルを含むプレートから始め、蓋を取り外さずにプラークを数え、既にカウントされているものを示すようにマークします。各セットの各プレートのカウントを繰り返します。一部のプレートには、数えるプラークが多すぎるか少なすぎる場合があります。理想的なプラーク数として 10 ~ 150 とします。

次に、異なる希釈および反復のプラーク番号値を一覧表示するテーブルを生成します。次に、理想的な数のプラーク数を含む希釈プレートの平均プラーク数値を計算する。この例では、これらは、10からマイナス3とマイナス4希釈プレートに形成されたプラークの平均数であった。さて、得られた平均プラーク値をそれぞれのファージ希釈因子で割ることによってファージ希釈係数を調整する。ここで、10からマイナス3及び10からマイナス4希釈プレートに形成されたプラークの平均数を、それぞれの希釈因子で割り、プラーク形成単位(PFU)の数を、ファージ混合物の100マイクロリットルで得た。値を1ミリリットル当たりPFUに変換するには、バクテリオファージオーバーレイ調製工程中に100マイクロリットルのファージ希釈ミックスのみが使用されたため、生成された値に10を掛け、10の追加希釈係数を生成しました。最後に、異なる希釈プレートから得られた値の平均を計算します。これにより、1 ミリリットルあたりの PFU の平均数が増加します。PFUの数は、元のサンプル中の感染性ファージ粒子の数に相当する。

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