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Transformation des cellules E. coli à l'aide d'une procédure adaptée de chlorure de calcium
 

Transformation des cellules E. coli à l'aide d'une procédure adaptée de chlorure de calcium

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Les bactéries sont remarquablement adaptables et un mécanisme qui facilite cette adaptation est leur capacité à prendre en molécules externes d'ADN. Un type d'ADN que les bactéries peuvent prendre est appelé un plasmide, un morceau circulaire d'ADN qui contient fréquemment des informations utiles, telles que les gènes de résistance aux antibiotiques. Le processus de modification des bactéries par de nouvelles informations génétiques incorporées à partir d'une source externe est appelé transformation. La transformation peut facilement être effectuée en laboratoire à l'aide d'Escherichia coli, ou E. coli.

Pour être transformées, les cellules E. coli doivent d'abord être rendues compétentes, ce qui signifie être capables de prendre des molécules d'ADN de leur environnement. Le protocole pour y parvenir est étonnamment simple, une courte incubation des cellules dans une solution de chlorure de calcium. Cette incubation fait en cesriciens les cellules des molécules d'ADN. Une fois que les cellules sont granulées par centrifugation, le supernatant est enlevé. L'ADN plasmide est maintenant ajouté aux cellules compétentes. Après avoir incubé les cellules avec de l'ADN, le mélange est brièvement chauffé à 42 degrés Celsius, suivi d'un refroidissement rapide sur la glace. Ce choc thermique provoque le transfert de l'ADN sur la paroi et les membranes de la cellule. Les cellules sont ensuite incubées dans des médias frais. Ensuite, les bactéries sont placées à 37 degrés pour leur permettre de refermer leurs membranes et d'exprimer des protéines résistantes.

Les cellules qui ont pris dans les plasmides copieront fidèlement l'ADN et le transmettent à leur progéniture et exprimeront toutes les protéines qui pourraient être codées par elle, y compris les médiateurs de résistance aux antibiotiques. Ces gènes de résistance peuvent être utilisés comme marqueurs sélectionnables pour identifier les bactéries qui ont été transformées avec succès parce que les cellules qui n'ont pas pris le plasmide n'exprimeront pas le produit du gène de résistance. Cela signifie que lorsque les cellules sont plaquées sur un milieu solide qui contient l'antibiotique approprié, seules les cellules qui ont pris le plasmide se développeront. La transformation des cellules dans une colonie croissante peut être confirmée en cultivant ces cellules dans les médias liquides pendant la nuit pour augmenter le rendement avant d'extraire l'ADN de l'échantillon. Une fois que l'ADN est isolé, un digest d'enzyme de restriction diagnostique peut être effectué. Puisque les enzymes de restriction coupent l'ADN dans les endroits prévisibles, exécution de ces digestes sur un gel devrait montrer un modèle prévisible si le plasmide désiré a été avec succès transformé. Par exemple, si le pUC19 est préparé et coupé avec l'enzyme de restriction HindIII, une seule bande de 2686 nucléotides doit être vu sur le gel.

Dans ce laboratoire, vous transformerez la souche E. coli DH-5 Alpha avec pUC19, puis confirmerez la transformation réussie par l'électrophorèse de gel d'ADN.

Avant de commencer la procédure, mettez l'équipement de protection individuelle approprié, y compris une blouse de laboratoire et des gants. Ensuite, stériliser l'espace de travail avec 70% d'éthanol.

Maintenant, préparez des cellules chimiquement compétentes en déposant une boucle pleine de bactéries sur une plaque stérile d'agar LB et en stries les bactéries avec une nouvelle boucle. Ensuite, incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, stérilisez à nouveau le dessus du banc avec 70 % d'éthanol et retirez la plaque de l'incubateur.

Inoculer une seule colonie bien isolée en 3 millilitres de bouillon LB dans un tube avec une boucle stérile. Ensuite, faire pousser la culture à 37 degrés Celsius pendant la nuit, avec des secousses à 210 tr/min. Le lendemain, mesurez la densité optique de la culture du jour au lendemain à l'utilisation d'un spectrophotomètre. Ensuite, ajoutez 100 millilitres de bouillon LB à un flacon d'un litre, et inoculez-le avec la culture de nuit à une densité optique de 0. 01. Maintenant, incuber la culture à 37 degrés Celsius avec des secousses, et vérifier l'OD600 toutes les 15 à 20 minutes jusqu'à ce que la culture atteint la phase de croissance à mi-exponentielle.

Après environ trois heures, transférer 50 millilitres de la culture dans deux bouteilles de polypropylène glacée. Ensuite, remettre les bouteilles sur la glace pendant 20 minutes pour refroidir. Ensuite, récupérer les cellules par centrifugation. Jetez les supernatants et placez les bouteilles à l'envers sur un essuie-tout. Ensuite, resuspendre la pastille bactérienne en cinq millilitres de chlorure de calcium glacé et tourbillonner soigneusement jusqu'à ce que la pastille se soit complètement dissoute. Ensuite, ajoutez encore 25 millilitres de la solution à la pastille bactérienne dissoute. Resuspendre l'autre granule bactérien tel que démontré précédemment. Après cela, répéter la centrifugation, et retirer les supernatants.

Si les cellules compétentes doivent être directement transformées, resuspendre chaque granule bactérienne en deux millilitres d'une solution de chlorure de calcium de 0,1 molaire glacée en faisant tourbillonner soigneusement les tubes. Pour commencer la procédure de transformation, transférer 50 microlitres de cellules compétentes à deux tubes de polypropylène de 1,5 millilitre étiquetés. Ensuite, ajoutez un microlitre d'ADN plasmide pUC19 à l'un des tubes. Mélanger délicatement, en évitant la formation de bulles, et incuber les deux tubes pendant 30 minutes sur la glace. Après l'incubation, transférer les tubes dans un bloc de chaleur et couver à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes. Transférer immédiatement les tubes sur la glace et couver pendant deux minutes. Maintenant, ajoutez 950 microlitres de milieu xcopique à chaque tube et incubez-les pendant une heure à 37 degrés Celsius pour permettre aux bactéries de récupérer, et exprimez le marqueur résistant aux antibiotiques encodé dans le plasmide.

Pour faire une dilution de 1 à 100, ajouter 990 microlitres de support SOC et 10 microlitres de suspension cellulaire à un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, faire une dilution de 1 à 10 en ajoutant 900 microlitres de supports SOC et 100 microlitres de suspension cellulaire à un tube de 1,5 millilitre. Ensuite, plaque10 microlitres des suspensions de cellules diluées et 100 microlitres du contrôle négatif, sur des plaques sélectives séparées contenant de l'ampicilline à l'aide d'un épandeur et incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Après l'incubation, compter les unités de formation des colonies, ou UFC, par plaque, obtenues par transformation, et consigner ces données. Pour vérifier que les transformateurs ont le plasmide pUC19, choisissez une seule colonie bien isolée dans une assiette avec une boucle stérile, et introduisez-la dans un tube contenant 3 millilitres de bouillon LB. Puis, incuber la culture à 37 degrés Celsius avec des secousses, du jour au lendemain. Le lendemain, utilisez un kit de préparation à l'ADN pour isoler l'ADN de 3 millilitres de la culture, selon les instructions du fabricant. Après avoir terminé la mini-préparation de l'ADN, digérez le 1 microgramme de pUC19 purifié avec une enzyme de restriction à 37 degrés Celsius pendant 1 heure. Maintenant, chargez 20 microlitres d'une échelle de poids moléculaire, 1 microgramme d'ADN plasmide digéré, et 1 microgramme d'ADN plasmide non digéré dans des puits consécutifs d'un gel d'agarose de 1% contenant 1 microgramme par bromure d'éthidium millilitre. Ensuite, faites fonctionner le gel pendant 1 heure à 95 volts. Enfin, visualisez le gel à l'aide d'un illuminateur UV.

Dans cette expérience, des cellules chimiquement compétentes E. coli DH5 Alpha ont été préparées à l'aide d'une adaptation de la procédure de chlorure de calcium, puis transformées avec le plasmide pUC19 pour déterminer l'efficacité de la transformation. Pour calculer l'efficacité de la transformation, utilisez les comptes cFU enregistrés pour les dilutions de 1 sur 100 et de 1 sur 10, et toutes les autres dilutions avec cFU comptent entre 30 et 300. Tout d'abord, le nombre enregistré de CFU, 246 dans cet exemple, est divisé par la quantité d'ADN, .0001 microgrammes ici, qui a été plaqué. Ensuite, ce nombre est divisé par le facteur de dilution utilisé pour donner l'efficacité de transformation dans les UFC par microgramme. Dans cet exemple, une dilution de 1 à 10 a été utilisée et 100 microlitres d'une solution de 1 millilitre ont été plaqués, donnant un facteur de dilution final de 0,01. Dans la voie plasmide non digérée, l'ADN circulaire peut apparaître comme deux ou trois bandes différentes de luminosité variable. C'est parce que l'ADN circulaire, non coupé peut exister dans plusieurs états de conformation différents, tels que supercoiled, cercle ouvert, ou plus linéaire, et chacun de ces se déplacent à travers le gel à des taux différents. L'analyse de la digestion récupérée d'ADN de plasmide a indiqué que le plasmide utilisé a une taille prévue de l'ADN de pUC19, 2.686 paires de base.

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