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Transformation von E. coli-Zellen mit einem angepassten Calciumchlorid-Verfahren
 

Transformation von E. coli-Zellen mit einem angepassten Calciumchlorid-Verfahren

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Bakterien sind bemerkenswert anpassungsfähig und ein Mechanismus, der diese Anpassung erleichtert, ist ihre Fähigkeit, externe DNA-Moleküle aufzunehmen. Eine Art von DNA, die Bakterien aufnehmen können, wird als Plasmid bezeichnet, ein kreisförmiges Stück DNA, das häufig nützliche Informationen enthält, wie Antibiotikaresistenzgene. Der Prozess der Veränderung von Bakterien durch neue genetische Informationen aus einer externen Quelle wird als Transformation bezeichnet. Die Transformation kann leicht im Labor mit Escherichia coli oder E. colidurchgeführt werden.

Um transformiert zu werden, müssen E. coli-Zellen zunächst kompetent gemacht werden, was bedeutet, dass sie DNA-Moleküle aus ihrer Umgebung aufnehmen können. Das Protokoll dazu ist überraschend einfach, eine kurze Inkubation der Zellen in einer Calciumchloridlösung. Diese Inkubation bewirkt, dass die Zellen für DNA-Moleküle durchlässig werden. Nachdem die Zellen durch Zentrifugation pelletiert wurden, wird der Überstand entfernt. Die Plasmid-DNA wird nun den zuständigen Zellen zugesetzt. Nach der Inkubation der Zellen mit DNA wird die Mischung kurz auf 42 Grad Celsius erhitzt, gefolgt von einer schnellen Abkühlung auf Eis. Dieser Hitzeschock bewirkt, dass die DNA über die Wand und die Membranen der Zelle übertragen wird. Die Zellen werden dann in frischen Medien inkubiert. Dann werden die Bakterien auf 37 Grad platziert, damit sie ihre Membranen wieder versiegeln und resistente Proteine ausdrücken können.

Die Zellen, die die Plasmide aufgenommen haben, kopieren die DNA originalgetreu und geben sie an ihre Nachkommen weiter und geben alle Proteine aus, die von ihr kodiert werden könnten, einschließlich Antibiotikaresistenzvermittlern. Diese Resistenzgene können als wählbare Marker verwendet werden, um Bakterien zu identifizieren, die erfolgreich transformiert wurden, weil Zellen, die das Plasmid nicht aufgenommen haben, das Resistenzgenprodukt nicht ausdrücken. Das bedeutet, dass nur Zellen wachsen, die das Plasmid aufgenommen haben, wenn die Zellen auf einem festen Medium plattiert sind, das das entsprechende Antibiotikum enthält. Die Transformation der Zellen in einer wachsenden Kolonie kann weiter bestätigt werden, indem diese Zellen über Nacht in flüssigen Medien kultiviert werden, um die Ausbeute zu erhöhen, bevor die DNA aus der Probe extrahiert wird. Sobald die DNA isoliert ist, kann ein diagnostisches Restriktionsenzym-Digest durchgeführt werden. Da Restriktionsenzyme DNA an vorhersehbaren Stellen schneiden, sollte das Ausführen dieser Digests auf einem Gel ein vorhersagbares Muster aufweisen, wenn das gewünschte Plasmid erfolgreich transformiert wurde. Wenn z. B. pUC19 mit dem Restriktionsenzym HindIII hergestellt und geschnitten wird, sollte ein einzelnes Band von 2686 Nukleotiden auf dem Gel zu sehen sein.

In diesem Labor transformieren Sie den E. coli-Stamm DH-5 Alpha mit pUC19 und bestätigen dann die erfolgreiche Transformation durch DNA-Gelelektrophorese.

Bevor Sie mit dem Eingriff beginnen, ziehen Sie die entsprechende persönliche Schutzausrüstung an, einschließlich laborierter Kleidung und Handschuhe. Als nächstes sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70% Ethanol.

Bereiten Sie nun chemisch kompetente Zellen vor, indem Sie eine Schleife voller Bakterien auf eine sterile LB-Agarplatte ablagern und die Bakterien mit einer neuen Schleife sättigen. Dann bebrüten Sie die Platte bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag die Bankplatte wieder mit 70% Ethanol sterilisieren und die Platte aus dem Inkubator entfernen.

Impfen Sie eine einzelne, gut isolierte Kolonie in 3 Milliliter LB-Brühe in einem Rohr mit einer sterilen Schleife. Dann wachsen Die Kultur bei 37 Grad Celsius über Nacht, mit Schütteln bei 210 RPM. Messen Sie am nächsten Tag die optische Dichte der Übernachtungskultur mit einem Spektralphotometer. Dann 100 Milliliter LB-Brühe in einen Ein-Liter-Kolben geben und mit der Nachtkultur bei einer optischen Dichte von 0 impfen. 01. Bebrüte nun die Kultur bei 37 Grad Celsius mit Schütteln und prüfe die OD600 alle 15 bis 20 Minuten, bis die Kultur die mittelexponentielle Wachstumsphase erreicht.

Nach ca. drei Stunden 50 Milliliter der Kultur auf zwei eiskalte Polypropylenflaschen übertragen. Dann legen Sie die Flaschen wieder auf Eis für 20 Minuten zu kühlen. Als nächstes, erholen Sie die Zellen durch Zentrifugation. Entsorgen Sie die Überräube und legen Sie die Flaschen auf einem Papiertuch auf den Kopf. Als nächstes das bakterielle Pellet in fünf Millilitere eiskalte Calciumchlorid-Magnesiumchloridlösung wieder aufsetzen und vorsichtig wirbeln, bis sich das Pellet vollständig aufgelöst hat. Dann fügen Sie weitere 25 Milliliter der Lösung auf das gelöste bakterielle Pellet. Setzen Sie das andere bakterielle Pellet wieder aus, wie zuvor gezeigt. Danach wiederholen Sie die Zentrifugation, und entfernen Sie die Überstande.

Wenn die zuständigen Zellen direkt transformiert werden, setzen Sie jedes bakterielle Pellet in zwei Millilitern einer eiskalten 0,1 Molkalziumchloridlösung wieder auf, indem Sie die Schläuche vorsichtig wirbeln. Um das Transformationsverfahren zu beginnen, übertragen Sie 50 Mikroliter kompetenter Zellen auf zwei beschriftete 1,5 Milliliter Polypropylenröhren. Fügen Sie dann einem der Röhren einen Mikroliter pUC19-Plasmid-DNA hinzu. Mischen Sie sanft, Vermeiden Blasenbildung, und inkubieren beide Rohre für 30 Minuten auf Eis. Nach der Inkubation die Rohre in einen Wärmeblock geben und 45 Sekunden lang bei 42 Grad Celsius brüten. Die Rohre sofort auf Eis übertragen und zwei Minuten bebrüten. Fügen Sie nun 950 Mikroliter SOC-Medien in jede Röhre und inkubieren Sie sie für eine Stunde bei 37 Grad Celsius, damit sich die Bakterien erholen können, und drücken Sie den antibiotikaresistenten Marker aus, der im Plasmid kodiert ist.

Um eine Verdünnung von 1 bis 100 herzustellen, fügen Sie 990 Mikroliter SOC-Medien und 10 Mikroliter Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Rohr ein. Dann machen Sie eine 1 bis 10 Verdünnung durch Zugabe von 900 Mikroliter SOC-Medien und 100 Mikroliter Zellsuspension zu einem 1,5 Milliliter-Rohr. Als nächstes 100 Mikroliter der verdünnten Zellsuspensionen und 100 Mikroliter der Negativkontrolle auf separate selektive Platten, die Ampicillin enthalten, mit einem Streuer und bebrüten die Platten 12 bis 16 Stunden bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie nach der Inkubation die koloniebildenden Einheiten oder KBE pro Platte, die durch Transformation erhalten wurden, und erfassen Sie diese Daten. Um zu überprüfen, ob die Transformanten das pUC19-Plasmid haben, wählen Sie eine einzelne, gut isolierte Kolonie aus einer Platte mit einer sterilen Schleife und führen Sie sie in ein Rohr mit 3 MilliliterN LB-Brühe ein. Dann bebrüten die Kultur bei 37 Grad Celsius mit Schütteln, über Nacht. Verwenden Sie am nächsten Tag ein DNA-Mini-Vorbereitungskit, um DNA aus 3 Millilitern der Kultur zu isolieren, gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nach Abschluss der DNA-Mini-Vorbereitung verdauen Sie das 1 Mikrogramm gereinigtes pUC19 mit einem Restriktionsenzym bei 37 Grad Celsius für 1 Stunde. Laden Sie nun 20 Mikroliter einer Molekulargewichtsleiter, 1 Mikrogramm verdauter Plasmid-DNA und 1 Mikrogramm unverdauter Plasmid-DNA in aufeinander folgende Brunnen eines 1% Agarose-Gels, das 1 Mikrogramm pro Milliliter Ethidiumbromid enthält. Dann laufen Sie das Gel für 1 Stunde bei 95 Volt. Schließlich visualisieren Sie das Gel mit einem UV-Beleuchtung.

In diesem Experiment wurden e. coli DH5 Alpha chemisch kompetente Zellen mittels einer Anpassung des Calciumchloridverfahrens hergestellt und dann mit dem Plasmid pUC19 transformiert, um die Transformationseffizienz zu bestimmen. Um die Transformationseffizienz zu berechnen, verwenden Sie die aufgezeichneten KBE-Zahlen für die 1 in 100 und 1 in 10 Verdünnungen, und alle anderen Verdünnungen mit KBE zählt zwischen 30 und 300. Erstens wird die aufgezeichnete KBE-Zahl, 246 in diesem Beispiel, durch die Menge der DNA geteilt, .0001 Mikrogramm hier, die plattiert wurde. Dann wird diese Zahl durch den Verdünnungsfaktor dividiert, der verwendet wird, um die Umwandlungseffizienz in KBE pro Mikrogramm zu geben. In diesem Beispiel wurde eine Verdünnung von 1 bis 10 und 100 Mikroliter einer 1-Milliliter-Lösung plattiert, was einen endgültigen Verdünnungsfaktor von 0,01 ergibt. In der unverdauten Plasmidspur kann die kreisförmige DNA als zwei oder drei verschiedene Bänder unterschiedlicher Helligkeit erscheinen. Dies liegt daran, dass die kreisförmige, ungeschnittene DNA in mehreren verschiedenen Konformationszuständen existieren kann, z. B. in übereinander geschraubten, offenen Kreisen oder linearer, und jede dieser DNA bewegt sich mit unterschiedlichen Raten durch das Gel. Die Analyse der wiedergewonnenen Plasmid-DNA-Verdauung ergab, dass das verwendete Plasmid eine erwartete Größe von pUC19 DNA hat, 2.686 Basenpaare.

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