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使用自适应氯化钙程序对大肠杆菌细胞的转化
 

使用自适应氯化钙程序对大肠杆菌细胞的转化

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细菌具有显著的适应性,促进这种适应的一个机制是它们能够接受外部DNA分子。细菌可以接受的一种DNA称为质粒,一种经常包含有用信息(如抗生素耐药性基因)的圆形DNA。细菌被来自外部来源的新遗传信息修饰的过程称为转化。使用大肠杆菌或大肠杆菌,可以在实验室中轻松进行转化。

为了被转化,大肠杆菌细胞必须首先变得称职,这意味着能够从他们的环境中获取DNA分子。实现此目的的协议非常简单,在氯化钙溶液中短暂孵育细胞。这种孵育使细胞变得可渗透DNA分子。细胞通过离心颗粒后,上清液被去除。质粒DNA现在被添加到有能力的细胞中。用DNA孵育细胞后,将混合物短暂加热到42摄氏度,随后在冰上快速冷却。这种热冲击导致DNA在细胞壁和膜上转移。然后,细胞在新鲜的培养中孵育。然后,将细菌置于37度,以使它们重新密封膜并表达抗性蛋白质。

那些接受质粒的细胞将忠实地复制DNA,并将其传给其后代,并表达任何可能由它编码的蛋白质,包括抗生素耐药性中介。这些抗性基因可用作可选择的标记物,以识别已经成功转化的细菌,因为未接受质粒的细胞不会表达抗性基因产物。这意味着,当细胞被镀在含有适当抗生素的固体介质上时,只有已经接受质粒的细胞才会生长。在从样本中提取DNA之前,通过在液体培养物中培养这些细胞来增加产量,可以进一步确认生长菌群中细胞的转化。一旦DNA被分离,就可以进行诊断限制酶消化。由于限制性酶在可预测的位置切割DNA,因此,如果所需的质粒成功转化,在凝胶上运行这些消化体应能显示可预测的模式。例如,如果使用限制性酶 HindIII 制备并切割 pUC19,则应在凝胶上看到 2686 核苷酸的单带。

在本实验中,您将用pUC19转化大肠杆菌菌株DH-5 Alpha,然后确认DNA凝胶电泳的成功转化。

在开始手术之前,请穿上适当的个人防护装备,包括实验室外套和手套。接下来,用 70% 乙醇对工作空间进行消毒。

现在,通过将充满细菌的循环沉积在无菌 LB 琼脂板上,用新的循环将细菌条纹,制备具有化学能力的细胞。然后,在37摄氏度的温度下孵育。第二天,再次用70%乙醇对台面进行消毒,然后从培养箱中取出盘子。

在具有无菌循环的管中,将单个隔离良好的菌群接种成 3 毫升 LB 肉汤。然后,在37摄氏度的温度下生长,在210 RPM下摇动。第二天,用分光光度计测量过夜培养的光学密度。然后,将 100 毫升 LB 肉汤加入一升烧瓶中,并在光学密度为 0 的过夜培养中接种。01. 现在,在37摄氏度的温度下用摇动孵育培养,每15至20分钟检查OD600,直到培养达到中度生长阶段。

约三小时后,将50毫升的培养剂转移到两个冰冷的聚丙烯瓶中。然后,将瓶子放回冰上20分钟冷却。接下来,通过离心恢复细胞。丢弃上生物,将瓶子倒置放在纸巾上。接下来,将细菌颗粒重新悬浮在五毫升冰冷的氯化钙氯化镁溶液中,并小心旋转,直到颗粒完全溶解。然后,再向溶解的细菌颗粒中加入25毫升的溶液。如前所述,重新悬浮其他细菌颗粒。在此之后,重复离心,并删除上生子。

如果主管细胞要直接转化,请小心地旋转管,将每个细菌颗粒重新悬浮在两毫升冰冷的 0.1 摩尔氯化钙溶液中。要开始转化过程,将 50 微升的合格细胞转移到两个标有 1.5 毫升的聚丙烯管中。然后,在其中一个管中加入一微升的pUC19质粒DNA。轻轻混合,避免气泡形成,并在冰上孵育两管30分钟。孵育后,将管子转移到热块,并在42摄氏度下孵育45秒。立即将管子转移到冰上,孵育两分钟。现在,在每个管中加入950微升的SOC培养基,在37摄氏度的温度下孵育一小时,使细菌得以恢复,并表达在质粒中编码的抗生素耐药标记。

要进行 1 到 100 的稀释,将 990 微升 SOC 介质和 10 微升电池悬浮液添加到 1.5 毫升的管中。然后,通过在1.5毫升管中加入900微升的SOC介质和100微升的细胞悬浮液,进行1至10的稀释。接下来,将100微升的稀释细胞悬浮液和100微升的负控制,放在含有阿霉素的单独选择性板上,使用扩张器在37摄氏度下孵育板12至16小时。孵育后,计算通过转化获得的每个板的菌落形成单位或CFU,并记录这些数据。为了验证转化剂是否具有pUC19质粒,从具有无菌循环的板中挑选一个隔离良好的菌落,并将其引入含有3毫升LB汤的管中。然后,在37摄氏度的温度下,用颤抖,一夜之间孵育文化。第二天,使用DNA迷你准备试剂盒,根据制造商的说明,从3毫升的培养物中分离出DNA。完成DNA小制备后,在37摄氏度下用限制性酶消化1微克的纯化pUC19,1小时。现在,将20微升的分子量阶梯、1微克消化质粒DNA和1微克未消化质粒DNA装入含有每毫升溴化1微克的1%的甘蔗糖凝胶的连续井中。然后,在 95 伏电压下运行凝胶 1 小时。最后,使用紫外线照明器可视化凝胶。

在本实验中,使用氯化钙程序的适应制备大肠杆菌DH5 Alpha化学能力细胞,然后用质粒pUC19进行转化,以确定转化效率。要计算转换效率,请使用记录的 CFU 计数,用于 100 中的 1 和 10 中的稀释,以及 CFU 计数介于 30 和 300 之间的任何其他稀释。首先,在本示例中记录的 CFU 计数 246 除以此处的 DNA 量 ,0001 微克,即镀。然后,这个数字除以稀释系数,用于给每微克的CCFUs的转换效率。在此示例中,使用 1 到 10 稀释,1 毫升溶液的 100 微升被镀,最终稀释系数为 0.01。在未消化的质粒通道中,圆形DNA可能显示为两个或三个不同亮度的波段。这是因为圆形、未切割的DNA可能存在于几个不同的构象状态中,如超卷曲、开放圆或更线性,并且每个DNA以不同的速率在凝胶中移动。对恢复的质粒DNA消化分析表明,所使用的质粒具有预期大小的pUC19DNA,2,686个碱基对。

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