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使用自适应氯化钙程序对大肠杆菌细胞的转化
 
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使用自适应氯化钙程序对大肠杆菌细胞的转化

Article

Overview

资料来源:纳塔利娅·马丁1号,安德鲁·范·阿尔斯特1号,瑞安农·勒维克1号,维克多·迪丽塔1号
1 密歇根州立大学微生物学和分子遗传学系

细菌有能力在称为水平基因转移的过程中交换遗传物质(脱氧核糖核酸,DNA)。结合外源性DNA提供了一种机制,细菌可以通过它获得新的遗传特性,使他们能够适应不断变化的环境条件,如抗生素或抗体的存在(1)或分子在自然栖息地发现(2) 水平基因转移有三种机制:转化、转导和共聚(3)。在这里,我们将专注于转化,细菌从环境中获取自由DNA的能力。在实验室中,转化过程有四个一般步骤:1) 制备合格细胞,2) 用DNA孵育合格细胞,3) 细胞恢复,4) 细胞的电镀,用于转化剂的生长(图1)。

Figure 1
图 1:转换过程的一般步骤。转化过程有四个一般步骤:1) 制备合格细胞,2) 用DNA孵育,3) 细胞的恢复和 4) 电镀细胞的生长转化剂。

要发生转化,受体细菌必须处于称为能力的状态。有些细菌能够因某些环境条件而变得自然而然。然而,许多其他细菌不能自然地胜任,或者这个过程的条件还不得而知。将DNA引入细菌的能力具有一系列研究应用:生成感兴趣的DNA分子的多个副本,表达大量蛋白质,作为克隆过程中的组成部分,以及其他。由于转化对分子生物学的价值,有几个协议旨在使细胞在自然能力条件未知时人为地具有能力。两种主要方法用于制备人工能力细胞:1)通过细胞的化学处理,2)将细胞暴露于电脉冲(电穿孔)。前者使用不同的化学物质,具体取决于在DNA和细胞表面之间产生吸引力的程序,而后者使用电场在细菌细胞膜中产生孔隙,DNA分子可以通过这些孔进入。化学能力最有效的方法是用二价阳离子孵育,最显著的是钙(Ca2+)45) 钙诱导能力是这里描述的程序 (6).该方法主要用于革兰氏阴性细菌的转化,是本方案的重点。

化学转化过程涉及一系列步骤,其中细胞暴露于阳离子诱导化学能力。这些步骤随后是温度变化 - 热休克 - 有利于由主管细胞(7)摄取外来DNA。细菌细胞包络呈负电荷。在革兰氏阴性细菌,如大肠杆菌,外膜是负电荷由于存在脂多糖(LPS)(8 )。这导致同样带负电荷的DNA分子排斥。在化学能力诱导中,带正电荷的钙离子中和这种电荷排斥,使DNA吸收到细胞表面(9)。钙处理和脱氧核糖核酸的孵育在冰上进行。随后,在较高温度(42°C)下进行孵育,进行热冲击。这种温度不平衡进一步有利于DNA的摄取。细菌细胞需要在中指数生长阶段,以承受热冲击处理;在其他生长阶段,细菌细胞对热量过于敏感,导致生存能力丧失,从而大大降低转化效率。

不同的DNA来源可用于转化。通常,在大肠杆菌的大多数实验室程序中,质粒、小圆形、双链DNA分子用于转化。要在转化后在细菌细胞中维持质粒,它们需要包含复制的来源。这使得它们可以在细菌细胞中独立于细菌染色体复制。并非所有的细菌细胞在转化过程中都得到转化。因此,转化产生转化细胞和非转化细胞的混合物。为了区分这两个群体,使用一种选择方法来识别获得质粒的细胞。疟原虫通常含有可选择的标记物,这些标记是编码一种具有生长优势的特征的基因(即对抗生素或化学物的抗药性或从生长辅助体中拯救)。转化后,细菌细胞被镀在选择性培养物上,这只允许转化细胞的生长。如果细胞转化,质粒对给定抗生素具有抗药性,选择性培养基将是含有该抗生素的生长介质。有几种不同的方法可以用来确认在选择性培养基中生长的菌落是转化剂(即已经合并了质粒)。例如,质粒可以使用质粒制备方法(10)从这些细胞中恢复,并消化以确认质粒大小。或者,菌落PCR可用于确认存在感兴趣的质粒(11)。

本实验的目的是利用氯化钙程序(12)的适应,制备大肠杆菌DH5+化学能力细胞,并用质粒pUC19对其进行转化,以确定转化效率。大肠杆菌菌株DH5+是分子生物学应用中常用的菌株。由于其基因型,特别是recA1和endA1,这种菌株可以提高插入稳定性,并在随后的制剂中提高质粒DNA的质量。由于转化效率随着DNA尺寸的增加而降低,因此,由于质粒pUC19体积小(2686 bp),因此在本协议中使用了质粒pUC19(参见https://www.mobitec.com/cms/products/bio/04_vector_sys/standard_cloning_vectors.html矢量映射)。pUC19对青霉素具有抗药性,因此,这是用于选择的抗生素。

Procedure

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该协议描述了使用氯化钙程序(12)的适应,制备和转化合格的大肠杆菌DH5+。

1. 设置

  1. 设备
    • 分 光 光度计
    • 索瓦尔离心机(或等效)
    • 台式离心机
    • 热块或水浴
    • 轨道摇床
    • 固定孵化器
    • 凝胶铸造托盘
    • 井梳
    • 电压源
    • 凝胶盒
    • 紫外线光源
    • 微波
  2. 解决方案和试剂
    • Luria-Bertani (LB) 汤 (10 g 酸酶水解液, 5 g 酵母提取物和 5 g 氯化钠在 1000 mL H2O))
    • 具有催化素抑制 (SOC) 的超级最佳肉汤: (2% (w/v) 锥酮, 0.5% (w/v) 酵母提取物, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2,10 mM MgSO4和 20 mM 葡萄糖)
    • CaCl2-MgCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2) 溶液.
    • M CaCl2溶液(如果细胞将立即转化)或 0.1M CaCl2溶液,含有 10% (v/v) 甘油(如果细胞将冷冻供将来使用)。
    • LB 琼脂板
    • LB琼脂蛋白选择性板(对于本实验,由于使用的质粒具有环异素电阻,因此使用了含有安霉素100μg/mL的LB琼脂蛋白板)
    • 大肠杆菌DH5+菌株
    • 疟原虫 pUC19 DNA (100 pg/ μl)
    • QIAprep 旋转迷你套件(奇根)
    • 欣德III 限制酶
    • 1 kb 加上 DNA 梯子
    • 低熔点阿加罗斯
    • 1X TAE 缓冲液(40 mM 三元底座、20 mM 醋酸和 1mM EDTA)
    • 溴化物(10mg/mL)
  3. 一般安全说明
    大肠杆菌DH5+被归类为生物安全等级1(BSL1)。这类微生物对健康成年人的感染威胁很小或根本没有威胁。然而,需要仔细操作微生物。

重要,本协议中的所有步骤都需要使用无菌技术,在冰或4°C温度下执行,除非另有说明。

2. 议定书

  1. 从冷冻的大肠杆菌DH5+(从在LB生长的过夜培养物中冷冻20%甘油)中分离出细菌在LB琼脂板上分离。 在 37°C 过夜(16-20 小时)孵育。
  2. 在管中接种单个菌落到 3 mL 的 LB 肉汤中。在 37°C 过夜(16-20 小时)下,在 210 rpm 下摇动。
  3. 测量隔夜培养的 OD600。使用隔夜培养剂在 1 升烧瓶中接种 100 mL 的 LB 肉汤至 OD600±0.01。每 15-20 分钟在分光光度计中监测 OD600 的 37°C 下大力孵化培养体(210 rpm),直到培养达到 OD600±0.35(约 3 小时)。
    注:为了有效地转化,细菌细胞需要处于指数中生长阶段。细胞的最大数量需要为108个细胞/mL,对于大多数大肠杆菌菌株,该细胞数对应于OD600=0.4。使用分光光度计可以测量OD600,从而确定细胞处于适当的生长阶段。如果此协议将用于其他菌株,则需要校准以确定以特定 OD600 值形成单位的菌落数量,以确定此相关性。
  4. 将培养的 50 mL 转移到 2 个冰冷的聚丙烯离心瓶中。将瓶子放在冰上20分钟冷却。
  5. 在 2700g(Sorval GSA 转子中 4100 rpm)下,在 4°C 下通过离心回收电池 10 分钟。
  6. 拆下上清液。将瓶子倒置放在垫子或纸巾上,将最后的痕迹排干。
  7. 将每个细菌颗粒重新悬浮到 30 mL 的 CaCl2-MgCl2 (80 mM MgCl2, 20 mM CaCl2)冰冷的溶液中。首先加入5 mL的溶液,仔细旋转,直到颗粒完全溶解,然后加入剩余的25 mL溶液。
  8. 重复步骤 2.4。
  9. 重复步骤 2.5。
  10. 如果主管细胞要直接转化,请小心地旋转管,将每个细菌颗粒重新悬浮到 2 mL 的 CaCl2 (0.1 M) 冷冰溶液中。如果使用此方法颗粒未重新悬浮,请通过轻轻上下移液(避免气泡形成)重新悬浮。
    或者,可以冷冻和储存适合的细胞,以供以后使用。要制备合格细胞的冷冻库存,将颗粒重新悬浮在含有10%(v/v)甘油的0.1M CaCl2溶液中的2ml。此解决方案需要冰冷。等分电池悬浮液放入冰冷的1.5 mL聚丙烯管中(每管160μl)。立即在干冰/乙醇浴中冷冻合格细胞。将管转移到-70°C冷冻室。
  11. 要转化CaCl2处理的细胞,将50μl的合格细胞转移到2个1.5ml聚丙烯管中。将pUC19质粒DNA的1μl(100 pg)添加到其中一个管中,使第二管没有DNA(阴性对照)。轻轻混合(避免气泡形成)。在冰上孵育30分钟。
    注:在转化时,在10μL或以下的体积中,DNA的DNA不应超过50 ng。
  12. 将管子转移到热块,并在42°C下孵育45s。
    注:热冲击是关键步骤。不要超过温度或孵育时间。
  13. 容易将管子转移到冰上。孵育2分钟。
  14. 加入950μL的SOC培养基,在37°C下孵育管1小时,使细菌恢复并表达质粒中编码的抗生素耐药标记。
  15. 在SOC(1/100稀释)中稀释1000μL的细胞悬浮液,在SOC(1/10稀释)中稀释1000μL的细胞悬浮液。将100μl的稀释剂以及控制板板涂到选择性板上,并用铲子扩散。通常,电镀 100 μL 的 1/100 和 1/10 稀释将产生足够的孔组形成单位 (cfu) 每个板的数量。理想情况下,这个数字应在30-300cfu之间,以便有足够的殖民地,但彼此分离。但是,cfu 的数量将取决于转换效率(请参阅数据分析和结果部分)。
  16. 在 37°C 下孵育板。转化的菌落应在12-16小时内出现(此范围将取决于细胞菌株和选择方法)。任何殖民地都不应在消极的控制下生长。
  17. 计数为变换获取的 cfu/板 (表 1)。
  18. 为了验证转化物含有pUC19质粒,将进行质粒制备和随后的消化。为此,在管中接种单个菌落,将3ml LB汤中接种。在 37°C 过夜(16-20 小时)下,在 210 rpm 下摇动。
  19. 根据制造商的说明,使用 QIAprep 旋转迷你套件准备质粒制剂。
  20. 在37°C下用限制性酶HindIII消化1μg纯化pUC19,1小时。
    注: 任何在pUC19多个克隆位点中切开的酶都可以用于此步骤。
组件
10X 限制消化缓冲器 2.5 μl
疟原虫 pUC19 1 μg
欣德 1 μl
H2O 20.5 μl (至 25 μl)
  1. 运行分子量阶梯,在含有1微克/mL溴化钠的1%腺胶凝胶中消化pUC19DNA和相同数量的未消化pUC19DNA,在95 V下1小时。
    注:时间和电压因使用的设备而异。
  2. 在紫外光下可视化凝胶。比较消化和未消化的pUC19 DNA的大小(图2)(参见数据分析和结果部分)。
    继续执行必要的步骤,根据每个特定转换实验的目标验证转换。

Figure 2
图2:从转化的DH5+细胞中消化恢复的质粒DNA。疟原体DNA是从经过改造的DH5®细胞中恢复的,用HindIII消化,在1%的角胶凝胶中运行,并用紫外线源(步骤2.19至2.22)可视化。

3. 数据分析和结果

为了计算转化效率,这是细胞在细胞外DNA中所占的一个指标,需要计算在转化中获得的菌落:

稀释 克福
1/100 34
1/10 246

表1:从变换实验中计算的菌落成形单位(cfu)。

转化效率 (TE) 是将 1 μg 质粒转化为给定容量的合格细胞所产生的 cfu 数量的度量。许多参数影响转化效率:质粒大小、细胞基因型、能力制备期间的生长阶段、转化方法等。在计算 TE 时,必须考虑在电镀之前执行了稀释(如果有),并将其纳入 cfu 的总数计算中。转换效率 (TE) 使用以下公式计算:

首先将 cfu 除以 DNA 的 μg,在此示例中为 0.0001μg。然后除以稀释系数的结果。在此示例中,使用 1/10 稀释,1 ml 溶液的 100μL 被镀(稀释: 1/10 × 100 μL /1000 μL = 0.01)。

细菌具有显著的适应性,促进这种适应的一个机制是它们能够接受外部DNA分子。细菌可以接受的一种DNA称为质粒,一种经常包含有用信息(如抗生素耐药性基因)的圆形DNA。细菌被来自外部来源的新遗传信息修饰的过程称为转化。使用大肠杆菌或大肠杆菌,可以在实验室中轻松进行转化。

为了被转化,大肠杆菌细胞必须首先变得称职,这意味着能够从他们的环境中获取DNA分子。实现此目的的协议非常简单,在氯化钙溶液中短暂孵育细胞。这种孵育使细胞变得可渗透DNA分子。细胞通过离心颗粒后,上清液被去除。质粒DNA现在被添加到有能力的细胞中。用DNA孵育细胞后,将混合物短暂加热到42摄氏度,随后在冰上快速冷却。这种热冲击导致DNA在细胞壁和膜上转移。然后,细胞在新鲜的培养中孵育。然后,将细菌置于37度,以使它们重新密封膜并表达抗性蛋白质。

那些接受质粒的细胞将忠实地复制DNA,并将其传给其后代,并表达任何可能由它编码的蛋白质,包括抗生素耐药性中介。这些抗性基因可用作可选择的标记物,以识别已经成功转化的细菌,因为未接受质粒的细胞不会表达抗性基因产物。这意味着,当细胞被镀在含有适当抗生素的固体介质上时,只有已经接受质粒的细胞才会生长。在从样本中提取DNA之前,通过在液体培养物中培养这些细胞来增加产量,可以进一步确认生长菌群中细胞的转化。一旦DNA被分离,就可以进行诊断限制酶消化。由于限制性酶在可预测的位置切割DNA,因此,如果所需的质粒成功转化,在凝胶上运行这些消化体应能显示可预测的模式。例如,如果使用限制性酶 HindIII 制备并切割 pUC19,则应在凝胶上看到 2686 核苷酸的单带。

在本实验中,您将用pUC19转化大肠杆菌菌株DH-5 Alpha,然后确认DNA凝胶电泳的成功转化。

在开始手术之前,请穿上适当的个人防护装备,包括实验室外套和手套。接下来,用 70% 乙醇对工作空间进行消毒。

现在,通过将充满细菌的循环沉积在无菌 LB 琼脂板上,用新的循环将细菌条纹,制备具有化学能力的细胞。然后,在37摄氏度的温度下孵育。第二天,再次用70%乙醇对台面进行消毒,然后从培养箱中取出盘子。

在具有无菌循环的管中,将单个隔离良好的菌群接种成 3 毫升 LB 肉汤。然后,在37摄氏度的温度下生长,在210 RPM下摇动。第二天,用分光光度计测量过夜培养的光学密度。然后,将 100 毫升 LB 肉汤加入一升烧瓶中,并在光学密度为 0 的过夜培养中接种。01. 现在,在37摄氏度的温度下用摇动孵育培养,每15至20分钟检查OD600,直到培养达到中度生长阶段。

约三小时后,将50毫升的培养剂转移到两个冰冷的聚丙烯瓶中。然后,将瓶子放回冰上20分钟冷却。接下来,通过离心恢复细胞。丢弃上生物,将瓶子倒置放在纸巾上。接下来,将细菌颗粒重新悬浮在五毫升冰冷的氯化钙氯化镁溶液中,并小心旋转,直到颗粒完全溶解。然后,再向溶解的细菌颗粒中加入25毫升的溶液。如前所述,重新悬浮其他细菌颗粒。在此之后,重复离心,并删除上生子。

如果主管细胞要直接转化,请小心地旋转管,将每个细菌颗粒重新悬浮在两毫升冰冷的 0.1 摩尔氯化钙溶液中。要开始转化过程,将 50 微升的合格细胞转移到两个标有 1.5 毫升的聚丙烯管中。然后,在其中一个管中加入一微升的pUC19质粒DNA。轻轻混合,避免气泡形成,并在冰上孵育两管30分钟。孵育后,将管子转移到热块,并在42摄氏度下孵育45秒。立即将管子转移到冰上,孵育两分钟。现在,在每个管中加入950微升的SOC培养基,在37摄氏度的温度下孵育一小时,使细菌得以恢复,并表达在质粒中编码的抗生素耐药标记。

要进行 1 到 100 的稀释,将 990 微升 SOC 介质和 10 微升电池悬浮液添加到 1.5 毫升的管中。然后,通过在1.5毫升管中加入900微升的SOC介质和100微升的细胞悬浮液,进行1至10的稀释。接下来,将100微升的稀释细胞悬浮液和100微升的负控制,放在含有阿霉素的单独选择性板上,使用扩张器在37摄氏度下孵育板12至16小时。孵育后,计算通过转化获得的每个板的菌落形成单位或CFU,并记录这些数据。为了验证转化剂是否具有pUC19质粒,从具有无菌循环的板中挑选一个隔离良好的菌落,并将其引入含有3毫升LB汤的管中。然后,在37摄氏度的温度下,用颤抖,一夜之间孵育文化。第二天,使用DNA迷你准备试剂盒,根据制造商的说明,从3毫升的培养物中分离出DNA。完成DNA小制备后,在37摄氏度下用限制性酶消化1微克的纯化pUC19,1小时。现在,将20微升的分子量阶梯、1微克消化质粒DNA和1微克未消化质粒DNA装入含有每毫升溴化1微克的1%的甘蔗糖凝胶的连续井中。然后,在 95 伏电压下运行凝胶 1 小时。最后,使用紫外线照明器可视化凝胶。

在本实验中,使用氯化钙程序的适应制备大肠杆菌DH5 Alpha化学能力细胞,然后用质粒pUC19进行转化,以确定转化效率。要计算转换效率,请使用记录的 CFU 计数,用于 100 中的 1 和 10 中的稀释,以及 CFU 计数介于 30 和 300 之间的任何其他稀释。首先,在本示例中记录的 CFU 计数 246 除以此处的 DNA 量 ,0001 微克,即镀。然后,这个数字除以稀释系数,用于给每微克的CCFUs的转换效率。在此示例中,使用 1 到 10 稀释,1 毫升溶液的 100 微升被镀,最终稀释系数为 0.01。在未消化的质粒通道中,圆形DNA可能显示为两个或三个不同亮度的波段。这是因为圆形、未切割的DNA可能存在于几个不同的构象状态中,如超卷曲、开放圆或更线性,并且每个DNA以不同的速率在凝胶中移动。对恢复的质粒DNA消化分析表明,所使用的质粒具有预期大小的pUC19DNA,2,686个碱基对。

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Results

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虽然TE取决于许多因素,但非商业能力细胞制剂,如这种,通常产生106至107转化剂每微克质粒。因此,这种制备,与TE = 2.46 x 108 cfu/μg,产生TE远远超出预期范围。当给定应用需要更高的转换效率时,可以使用附加协议来制造超能的单元(13)。

对从转化细胞中恢复的质粒DNA的消化分析表明,该质粒具有pUC19DNA(2686 bp)的预期大小。

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Applications and Summary

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转化是一种将外源DNA引入细菌细胞的有力方法,是实验室中许多分子生物学应用的关键。此外,它通过在自然界中发挥重要作用,允许细菌细胞交换遗传物质,从而增加遗传变异,并允许获得不同的有益特性,以便在各种条件下生存。许多细菌菌株编码自然能力所需的基因。然而,这些基因的诱导条件仍然未知。需要进一步的研究来确定这些条件。

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