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適応塩化カルシウム手順を用いて大腸菌細胞の形質転換
 

適応塩化カルシウム手順を用いて大腸菌細胞の形質転換

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細菌は非常に適応可能であり、この適応を容易にする1つのメカニズムは、外部DNA分子を取り込む能力である。細菌が取り込むことができるDNAの1つのタイプはプラスミドと呼ばれ、抗生物質耐性遺伝子などの有用な情報を頻繁に含むDNAの円形部分である。外部ソースから組み込まれた新しい遺伝情報によって細菌が改変される過程を、形質転換と呼ばれる。大腸菌または大腸菌を用いて実験室で簡単に変換を行うことができる。

形質転換するためには、まず大腸菌細胞を有能にしなければならず、それは環境からDNA分子を取り込むことができることを意味する。これを達成するためのプロトコルは、驚くほど簡単で、塩化カルシウム溶液中の細胞の短いインキュベーションである。このインキュベーションは、細胞がDNA分子に透過性になる原因となります。細胞が遠心分離によってペレット化された後、上清が除去される。プラスミドDNAが有能な細胞に追加されるようになりました。DNAで細胞をインキュベートした後、ミックスは一時的に摂氏42度に加熱され、その後、氷上で急速に冷却されます。このヒートショックにより、DNAが細胞の壁や膜を横切って転送されます。細胞は、その後、新鮮な媒体でインキュベートされます。その後、細菌は37度に配置され、膜を再シールし、耐性タンパク質を発現させることができます。

プラスミド中に取り込んだ細胞は、DNAを忠実にコピーして子孫に渡し、抗生物質耐性メディエーターを含む、それによってコードされる可能性のあるタンパク質を発現します。これらの耐性遺伝子は、プラスミドを取り込んでいない細胞が耐性遺伝子産物を発現しないため、正常に形質転換された細菌を同定するための選択可能なマーカーとして使用することができる。これは、細胞が適切な抗生物質を含む固体培地でめっきされると、プラスミドを取り込んだ細胞だけが成長することを意味します。増殖コロニーにおける細胞の形質転換は、試料からDNAを抽出する前に収率を高めるために一晩液体媒体でそれらの細胞を培養することによってさらに確認することができる。DNAを単離すると、診断制限酵素ダイジェストを行うことができます。制限酵素は予測可能な場所でDNAを切断するので、これらのダイジェストをゲル上で実行すると、所望のプラスミドが正常に形質転換された場合、予測可能なパターンを示す必要があります。例えば、pUC19を調製し、制限酵素HindIIIで切断した場合、2686ヌクレオチドの単一バンドがゲル上に見られる必要があります。

この研究室では、pUC19で大腸菌株DH-5 αを変換し、DNAゲル電気泳動による正常な形質転換を確認します。

手順を開始する前に、ラボコートや手袋を含む適切な個人用保護具を着用してください。次に、70%のエタノールでワークスペースを殺菌します。

さて、無菌LB寒天プレートに細菌のループフルを堆積させ、新しいループで細菌をストリークすることによって、化学的に有能な細胞を調べます。その後、一晩37°Cでプレートをインキュベートします。翌日、再び70%エタノールでベンチトップを殺菌し、インキュベーターからプレートを取り出します。

単一の、よく分離されたコロニーを無菌ループを持つチューブ内のLBスープの3ミリリットルに接種する。その後、210 RPMで揺れで、一晩で摂氏37度で培養を成長させます。翌日、分光光度計で一晩培養の光学密度を測定する。次いで、1リットルフラスコに100ミリリットルのLBスープを加え、光学密度0で一晩培養して接種する。01. 今、揺れで37°Cで培養し、培養が指数関数的な成長段階に達するまで15〜20分ごとにOD600をチェックします。

約3時間後、培養物50ミリリットルを2本の冷たいポリプロピレンボトルに移します。その後、ボトルを氷の上に戻し、20分間冷まします。次に、遠心分離を介して細胞を回復します。上清を捨て、ボトルをペーパータオルの上に逆さまに置きます。次に、冷たい塩化カルシウム塩化マグネシウム溶液の5ミリリットルで細菌ペレットを再中断し、ペレットが完全に溶解するまで慎重に旋回します。次に、溶解した細菌ペレットに溶液の別の25ミリリットルを添加する。前に示したように、他の細菌ペレットを再中断します。この後、遠心分離を繰り返し、上清を取り除きます。

有能な細胞が直接形質転換される場合は、チューブを慎重に旋回することにより、氷冷0.1モル塩化カルシウム溶液の2ミリリットルに各細菌ペレットを再停止します。形質転換手順を開始するには、50マイクロリットルの有能な細胞を2つの標識された1.5ミリリットルポリプロピレンチューブに移します。次に、pUC19プラスミドDNAの1マイクロリットルをチューブの1つに添加する。泡の形成を避け、穏やかに混合し、氷の上で30分間両方のチューブをインキュベートします。インキュベーション後、チューブをヒートブロックに移し、42°Cで45秒間インキュベートします。すぐにチューブを氷に移し、2分間インキュベートします。次に、各チューブに950マイクロリットルのSOC培地を追加し、37°Cで1時間インキュベートして細菌が回復し、プラスミドにコードされた抗生物質耐性マーカーを発現させます。

1~100°Cの希釈を行うには、990マイクロリットルのSOCメディアと10マイクロリットルのセルサスペンションを1.5ミリリットルのチューブに加えます。次いで、1.5ミリリットルのチューブに900マイクロリットルのSOC培体と100マイクロリットルの細胞懸濁液を加えて1~10希釈する。次に、希釈された細胞懸濁液の100マイクロリットルと負の対照の100マイクロリットルをプレートし、拡散機を用いてアンピシリンを含む別々の選択的プレート上に、12~16時間37°Cでプレートをインキュベートする。インキュベーション後、変換によって得られたコロニー形成単位(CFE)をプレートごとにカウントし、これらのデータを記録する。形質転換体にpUC19プラスミドがあることを確認するには、無菌ループを持つプレートから単一の、よく分離されたコロニーを選び、LBスープの3ミリリットルを含むチューブに導入します。その後、一晩、揺れで摂氏37度で培養をインキュベートします。翌日、DNAミニ準備キットを使用して、製造元の指示に従って、培養物の3ミリリットルからDNAを分離します。DNAミニ準備を完了した後、1時間37°Cの制限酵素で精製pUC19の1マイクログラムを消化する。さて、分子量はしごの20マイクロリットル、消化されたプラスミドDNAの1マイクログラム、および1マイクログラムの未消化プラスミドDNAを、1ミリリットル当たり1マイクログラムを含む1%のアガロースゲルの連続したウェルに積み込む。その後、95ボルトで1時間ゲルを実行します。最後に、UVイルミレータでゲルを視覚化します。

この実験では、大腸菌DH5アルファ化学的に有能な細胞を塩化カルシウム手順の適応を用いて調製し、次いでプラスミドpUC19で形質転換効率を決定した。変換効率を計算するには、記録された CFU カウントを 100 で 1 回、10 希釈で 1 回、CFU が 30 ~ 300 の他の希釈を使用します。まず、記録されたCFUカウントは、この例では246を、DNAの量で割って、ここで.0001マイクログラム、めっきされた。次に、この数値は、マイクログラムあたりのCFUの変換効率を与えるために使用される希釈係数で割られる。この例では、1~10の希釈を用いて、1ミリリットル溶液の100マイクロリットルをめっきし、最終的な希釈係数を0.01にした。未消化プラスミドレーンでは、円形DNAは、様々な明るさの2つまたは3つの異なるバンドとして現れることがあります。これは、円形の切断されていないDNAは、スーパーコイル状、開いた円、またはより線形など、いくつかの異なる立体構造状態に存在し、これらの各々が異なる速度でゲルを通過する可能性があるためです。回収されたプラスミドDNA消化の分析は、使用されるプラスミドがpUC19 DNA、2,686塩基対の予想サイズを有することを示した。

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