To-Photon Laser-induceret neurale skade: En metode til at observere Axon Degeneration og regenerering i Drosophila Larver

- Begynd med at montere en ren, bedøvet larve under et glasdæksel slip med hovedet op. Næste, udsætte det område af interesse ved forsigtigt at skubbe dækslet slip til at rulle larven og justere sin position. Brug confocal billeddannelse til at finde larven neurale celler.

Derefter udsætte målet axon til en to-foton laser ved en højere effekt end bruges til billeddannelse til at fremkalde skade. En to-foton laser bruges på grund af sin evne til at trænge ind og præcist lokalisere skader i levende væv med minimal skade på det omgivende væv.

Stop lasereksponeringen med det samme, når der er skader på målneuron, hvilket resulterer i axotomi eller afskæring af axonen. Endelig skal du afbilde den skadede neuron for at se dens degeneration og efterfølgende regenerering på de ønskede tidspunkter.

I eksempelprotokollen monterer vi en larve til mikroskopi, fremkalder skade på larvesensoriske neuroner og sporer neural regenerering.

- Begynd med en bedøvende larverne. I en røghætte skal du placere en 60-millimeter glasskål i en 15 centimeter plast petriskål. Fold derefter et stykke silkepapir og læg det i glasfaddet. Placer drue agarpladen på vævet, efter at diethyletheren er tilføjet.

Dernæst på et glas dias sted en dråbe halocarbon 27 olie i midten, og læg en plet af vakuumfedt på hvert af de fire hjørner. Brug derefter pincet til at overføre en larve på agarpladen og dæk glaspladen for at bedøve larven. Så snart lavaen holder op med at bevæge sig, skal du forsigtigt overføre den til halocarbonolien med hovedet oprejst.

Dernæst skal du bruge blid kraft til at skubbe dækslet slip til at rulle de celler, der skal ablated til, hvor de to-foton laser vil lettest ramme dem. Placeringen vil variere afhængigt af, hvad neuroner bliver målrettet. Nu sikre samling på de to-foton mikroskop fase og fokusere på celler af interesse ved hjælp af en 40x olie nedsænkning mål.

I softwaren skal du skifte til scanningstilstand og indlæse den gemte protokol. Sørg for, at pinhole åbnes hele vejen.

Stop derefter livescanningen, så beskæringsknappen bliver tilgængelig. Brug beskæringsfunktionen til at justere scanningsvinduet for at fokusere målområdet på netop det mulige skadessted. Åbn derefter et nyt billedvindue. Nu skal du reducere scanningshastigheden og øge laserintensiteten.

Skift derefter tilbage til det oprindelige billedvindue, og vælg livetilstanden, og find det område, der lige var målrettet, ved at justere fokus.

- En god indikation af vellykket skade er udseendet af et lille krater, ringlignende struktur eller lokaliseret snavs lige på skadesstedet.

- Fjern nu forsigtigt dækslet, og overfør den skadede larve på en ny plade med gærpasta. Sæt pladen i en 60 millimeter skål sammen med et propionsyre-gennemblødt væv.

For efterfølgende billeddannelse af larven, gøre brug af den gemte confocal setup og indsamle z stak billeder med en 25x mål. Sørg for at medtage normalisering punkt, så regenerering kan kvantificeres.