Encyclopedia of Experiments: Biology
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Transcript
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- Comece montando uma larva limpa e anestesiada sob um deslizamento de tampa de vidro com a cabeça para cima. Em seguida, exponha a área de interesse empurrando suavemente o deslizamento da tampa para rolar a larva e ajuste sua posição. Use imagens confocal para localizar as células neurais da larva. Identifique um axônio específico em uma das células neurais alvo como local para lesão.
Em seguida, exponha o axônio alvo a um laser de dois fótons a uma potência maior do que o usado para a imagem para induzir danos. Um laser de dois fótons é usado devido à sua capacidade de penetrar e localização precisamente de danos dentro do tecido vivo com danos mínimos ao tecido circundante.
Pare a exposição ao laser imediatamente quando houver danos ao neurônio alvo, resultando em axotomia, ou corte do axônio. Por fim, imagem do neurônio ferido para ver sua degeneração e subsequente regeneração nos pontos de tempo desejados.
No protocolo de exemplo, vamos montar uma larva para microscopia, induzir danos aos neurônios sensoriais larvais e rastrear a regeneração neural.
- Comece com uma anesthetização das larvas. Em um capô de fumaça, coloque uma placa de vidro de 60 milímetros em uma placa de petri plástica de 15 centímetros. Em seguida, dobre um pedaço de papel de tecido e coloque-o na placa de vidro. Coloque a placa de ágar de uva no tecido após a entrada do éter de dietil.
Em seguida, em uma lâmina de vidro coloque uma gota de óleo de halocarbono 27 no centro, e coloque uma mancha de graxa de vácuo em cada um dos quatro cantos. Em seguida, use fórceps para transferir uma larva para a placa de ágar e cubra o prato de vidro para anestesiar a larva. Assim que a lava parar de se mover, transfira-a cuidadosamente para o óleo de halocarboneto com a cabeça ereta.
Em seguida, use força suave para deslizar o deslizamento de cobertura para rolar as células para serem abladas para onde o laser de dois fótons irá mais facilmente atingi-los.
No software, mude para o modo de digitalização e carregue o protocolo salvo. Certifique-se de que o pinhole está aberto todo o caminho.
Em seguida, pare a varredura ao vivo para que o botão de corte fique disponível. Usando a função de corte, ajuste a janela de varredura para concentrar a área alvo apenas no local prospectivo da lesão. Em seguida, abra uma nova janela de imagem. Agora reduza a velocidade de varredura e aumente a intensidade do laser. Em seguida, alterne o botão contínuo para iniciar e pare a varredura.
Em seguida, mude de volta para a janela de imagem original e selecione o modo ao vivo, e encontre a região que foi apenas alvo ajustando o foco.
- Uma boa indicação de ferimentos bem sucedidos é o aparecimento de uma pequena cratera, estrutura semelhante a um anel ou detritos localizados bem no local da lesão.
- Agora remova cuidadosamente o deslizamento da tampa e transfira a larva ferida para uma nova placa com pasta de levedura. Coloque a placa em uma antena de 60 milímetros junto com um tecido propiônico encharcado de ácido.
Para imagens subsequentes da larva, faça uso da configuração confocal salva e colete imagens de pilha z com um objetivo de 25x. Certifique-se de incluir o ponto de normalização para que a regeneração possa ser quantificada.
