Lesión neuronal inducida por láser de dos fotones: un método para observar la degeneración y regeneración del axón en larvas de drosophila

- Comience montando una larva limpia y anestesiada debajo de un resbalón de cubierta de vidrio con la cabeza hacia arriba.

A continuación, exponga el axón objetivo a un láser de dos fotones a una potencia mayor de la utilizada para las imágenes para inducir daño.

Detener la exposición láser inmediatamente cuando hay daño a la neurona objetivo, lo que resulta en axotomía, o cortar el axón. Por último, imagen de la neurona lesionada para ver su degeneración y posterior regeneración en los puntos de tiempo deseados.

En el protocolo de ejemplo, montaremos una larva para la microscopía, inducimos daños a las neuronas sensoriales larvarias y rastrearemos la regeneración neuronal.

- Comience con una anestesia de las larvas. En una capucha de humo, coloque una placa de vidrio de 60 milímetros en una placa de petri de plástico de 15 centímetros.

A continuación, en un tobogán de vidrio coloque una gota de aceite de halocarbono 27 en el centro, y coloque un punto de grasa de vacío en cada una de las cuatro esquinas. Luego use fórceps para transferir una larva a la placa de agar y cubrir el plato de vidrio para anestesiar la larva. Tan pronto como la lava deje de moverse, transfiérala cuidadosamente al aceite de halocarbono con la cabeza erguida.

A continuación, utilice la fuerza suave para deslizar el resbalón de la cubierta para rodar las células para ser ablated a donde el láser de dos fotones más fácilmente golpearlos. La ubicación variará dependiendo de qué neuronas están siendo dirigidas. Ahora asegurar el montaje en la etapa de microscopio de dos fotones y centrarse en las células de interés utilizando un objetivo de inmersión de aceite 40x.

En el software, cambie al modo de escaneo y cargue el protocolo guardado.

A continuación, detenga la exploración en vivo para que el botón de recorte esté disponible. Usando la función de recorte, ajuste la ventana de escaneo para enfocar el área objetivo solo en el posible sitio de lesiones.

A continuación, vuelva a la ventana de imágenes original y seleccione el modo en vivo y busque la región a la que acaba de dirigirse ajustando el foco.

- Una buena indicación de lesiones exitosas es la aparición de un pequeño cráter, estructura similar a un anillo o escombros localizados justo en el sitio de la lesión.

- Ahora retire cuidadosamente el resbalón de la cubierta, y transfiera la larva lesionada a un plato nuevo con pasta de levadura. Ponga el plato en un plato de 60 milímetros junto con un tejido empapado en ácido propionico.

Para imágenes posteriores de la larva, haga uso de la configuración confocal guardada y recoja imágenes de pila z con un objetivo de 25x. Asegúrese de incluir el punto de normalización para que la regeneración pueda cuantificarse.