Injektion von adulten Drosophila Fliegen: Eine Methode der Verbindung oder Etikettenlieferung

- Bereiten Sie verjüngte Injektionsnadeln vor, indem Sie dünnwandige Glaskapillaren mit einem Nadelzieher ziehen. Halten Sie eine Nadel unter dem Mikroskop und brechen Sie die Spitze, um sicherzustellen, dass die Öffnung gerade groß genug ist, um die erwachsene Fliege Nagelhaut zu durchbohren, ohne sie mehr als nötig zu verwunden. Messen Sie das Injektionsvolumen, indem Sie Ihre Nadel mit einer sterilen Farbstoff- und Salzpufferlösung beladen und dann auf einen Tropfen Mineralöl auf einem Bühnenmikrometer auswerfen. Verwenden Sie die Skala auf dem Mikrometer, um den Durchmesser des ausgeworfenen Tröpfchens zu messen, das zur Berechnung des Volumens verwendet werden kann. Einstellungen entsprechend.

Laden Sie die Nadel mit Ihrer Injektionslösung und montieren Sie sie auf eine Injektionsdüse. Betäueln Sie Ihre Fliegen mit CO2 und ordnen Sie sie auf einem CO2-Flypad an, das sie anästhesiert hält. Sobald die Fliegen in der richtigen Ausrichtung für Ihr Experiment sind, fahren Sie mit den Injektionen fort. Im Beispielprotokoll werden wir erwachsene Fliegen mit fluorescein-markierten Partikeln für die In-vivo-Bildgebung injizieren.

- Nach dem Ziehen dünnwandigen Glaskapillaren mit einem Nadelzieher, Verwenden Sie ein Mikrometer, um die Nadel unter einem Mikroskop zu halten und verwenden Sie nummer fünf Feinpunkt-Edelstahl-Pinzette, um die Spitze auf einen 100-Mikrometer-Spitzendurchmesser zu brechen. Um das Volumen der Flüssigkeit zu messen, die in jede Fliege injiziert wird, laden Sie eine Kapillarnadel mit steriler 5% Lebensmittelfärbung in PBS und vertreiben die Flüssigkeit auf einen Tropfen Mineralöl auf einem 0,01 Millimeter Großen Mikrometer.

10 Mikroliter 1,6 Milligramm pro Milliliter Partikel auf ein kleines Quadrat Parafilm geben und die Flüssigkeit in die Nadel ziehen. Montieren Sie die Nadel in die Injektordüse und säumen Sie die anästhesierten Fliegen entlang ihres vorgesehenen Bereichs auf dem Fliegenpolster, ventrale Seite nach oben, mit den Köpfen nach vorne des Pads ausgerichtet. Legen Sie die Fläschchen in den entsprechenden Bereichen auf der Bank und injizieren Sie die Fliegen an der oberen Ecke des Bauches mit fünf 100 Millisekunden Pumpen Flüssigkeit, um etwa 10 Nanoliter Partikel insgesamt zu liefern. die Zeit auf der Durchstechflasche.

Als nächstes laden Sie eine neue Nadel mit 0,4% Trypan Blue Lösung und stellen Sie den pneumatischen Injektor auf "gated", um einen konstanten Luftstrom zu ermöglichen, um die Flüssigkeit aus der Nadel zu schieben. 30 Minuten nach der ersten Injektion, injizieren Sie jeden Fliegenbauch mit Trypan Blue, bis die Bauchmuskeln voll und distended sind. Montieren Sie die Fliegen auf Mikroskop-Dias mit elektrischem Band ventral Seite nach unten, drücken Sie die Flügel zur Seite der Fliege, um sie auf das Band zu sichern. Dann drücken Sie sanft den Kopf in das Band, um sicherzustellen, dass die Fliege nicht bewegt.