Обработка ног насекомых для флуоресценции микроскопии: метод сохранения нервно-мышечных структур для визуализации

- Для начала погрузите обезболивающих насекомых в 70% этанолового раствора, чтобы уменьшить гидрофобность кутикулы. Затем промойте и пронизьте ткань фосфатно-буферизированным солевым раствором, содержащим моющее средство, по крайней мере 30 минут, чтобы позволить проникновению тканей во время фиксации.

Далее, удалить голову и живот из грудной клетки. Используйте типсы, чтобы применить мягкое давление на coxa-грудной клетки соединения, и отделить ногу. Осторожно поместите ноги в ледяной 4% параформальдегид раствор на ночь, чтобы позволить ему проникнуть в ткани. Paraformaldehyde фиксирует ткани путем перекрестного связывания белков.

Затем удалите раствор фиксации и промыть ткань несколько раз фосфатно-буферным солевым раствором, содержащим моющее средство. Перед монтажом поместите ноги в чистый или слегка разбавленный монтажный буфер, по крайней мере один день, чтобы обеспечить достаточно времени для того, чтобы буфер вошел в ткань.

Наконец, смонтировать ноги в капле монтажной среды. Используйте пространство между слайдом микроскопа и крышкой, чтобы предотвратить повреждение образца, и закрепить крепление лаком для ногтей.

В следующем примере мы увидим вскрытие, фиксацию и монтаж ног Drosophila melanogaster.

- Начните с заполнения соответствующего количества скважин в стеклянной многоухоленной пластине с 70% этанола. Используйте кисть, чтобы добавить от 15 до 20 углекислого газа анестезировал мух любого возраста или пола к каждой скважине, и осторожно мазок мух в этанол, пока они полностью погружены.

После не более чем одной минуты, промыть мух в три раза с 0,3% неионные сурфактант моющего средства раствора в фосфат-буферной солевой раствор, по крайней мере 10 минут за стирку. После последней стирки, использовать миппы, чтобы удалить голову и живот каждой мухи, не повреждая грудной сегмент или ноги, и использовать кончик пары тонких типсов, чтобы мягко, но твердо применять давление на кокса-грудной перекресток

Поместите ноги в один колодец новой многоярдовой пластины, содержащей свежеприготовленные 4% параформальдегида на льду, для ночной инкубации при 4 градусах по Цельсию.

- Важно, чтобы подтолкнуть ноги мягко в буфер фиксации, не давая им плавать, чтобы получить хорошо закрепленные ноги.

- На следующий день, мыть ноги пять раз в свежем 0,3% неионные сурфактант моющее средство решение в течение 20 минут за стирку. После последнего мытья, заменить моющее средство с монтажом среды и держать ноги в монтажной среде, по крайней мере 24 часов.

На следующий день добавьте около 20 микролитров 70% глицерола рядом с покрытым концом слайда стеклянного микроскопа и накройте глицерол 22 на 22 миллиметра крышкой. Далее добавьте около 10-микролитровую линию монтажной среды справа от крышки и нанесите вторую 30-микролитровую линию монтажной среды справа от линии 10 микролитров.

Используя тонкие щипцы, перенесите одну ногу из многоуровной пластины в каплю среднего до 10-микролитровой полосы монтажной среды во внешней стороне вверх или вниз ориентации. Повторите до тех пор, пока шесть-восемь ног были установлены и выровнены, и поместите второй крышкой над ногами так, что второй coverslip лежит немного на первом coverslip. Затем, используйте лак для ногтей на каждом углу крышки, чтобы обеспечить их.