Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Başlamak için, kıtılın hidrofobikliğini azaltmak için uyuşturulmuş böcekleri% 70 etanol çözeltisine batırın. Daha sonra, fiksasyon sırasında doku penetrasyonunu sağlamak için en az 30 dakika boyunca bir deterjan içeren fosfat tamponlu salin ile dokuyu yıkayın ve permeabilize edin.
Daha sonra, başı ve karnı torakstan çıkarın. Coxa-toraks kavşağına hafif basınç uygulamak için forseps kullanın ve bacağı ayırın. Bacakları, dokuya nüfuz etmesine izin vermek için bir gecede buz gibi% 4 paraformaldehit çözeltisine dikkatlice yerleştirin. Paraformaldehit proteinleri çapraz bağlayarak dokuları sabitler.
Daha sonra fiksasyon solüsyonunu çıkarın ve dokuyu deterjan içeren fosfat tamponlu salin ile birkaç kez yıkayın. Montajdan önce, tamponun dokuya girmesi için yeterli zaman sağlamak için bacakları en az bir gün boyunca saf veya hafif seyreltilmiş montaj tamponu içine yerleştirin.
Son olarak, bacakları bir damla montaj ortamına monte edin. Numunenin hasar görmesini önlemek için mikroskop kaydırağı ile kapak parçası arasında bir aralayıcı kullanın ve montajı oje ile sabitleyin.
Aşağıdaki örnekte, Drosophila melanogaster bacaklarının diseksiyonunu, fiksasyonunu ve montajını göreceğiz.
- Bir cam multiwell tabağa uygun sayıda kuyuyu% 70 etanol ile doldurarak başlayın. Her kuyuya herhangi bir yaş veya cinsiyetten 15 ila 20 karbondioksit uyuşturulmış sinek eklemek için bir fırça kullanın ve sinekleri tamamen suya gömülene kadar hafifçe etanol içine koyun.
Bir dakikadan fazla kalmadıktan sonra, sinekleri yıkama başına en az 10 dakika fosfat tamponlu salin içinde% 0,3 noyonik yüzey aktif deterjan çözeltisi ile üç kez durulayın. Son yıkamadan sonra, torasik segmente veya bacaklara zarar vermeden her bir sineğin başını ve karnını çıkarmak için toka uçlarını kullanın ve bir bacağı torasik segmentten ayırmak için coxa-toraks kavşağına hafifçe ama sıkıca basınç uygulamak için bir çift ince önsezi kullanın.
Bacakları, 4 santigrat derecede bir gecede inkübasyon için buz üzerinde taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit içeren yeni bir multiwell plakasının bir kuyusuna yerleştirin.
- Bacakları iyi sabitlenmiş bacaklar elde etmek için yüzmelerine izin vermeden fiksasyon tamponuna hafifçe itmek önemlidir.
- Ertesi gün, bacakları yıkama başına 20 dakika boyunca taze% 0,3 noyonik yüzey aktif deterjan çözeltisinde beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra deterjanı montaj ortamı ile değiştirin ve bacakları en az 24 saat montaj ortamında tutun.
Ertesi gün, cam mikroskop kaydırağın kaplanmış ucunun yanına yaklaşık 20 mikrolitre% 70 gliserol ekleyin ve gliserol'ü 22 ila 22 milimetrelik bir kapakla örtün. Daha sonra, kapak çizgisinin sağ kısmına yaklaşık 10 mikroliterlik montaj ortamı hattı ekleyin ve 10 mikroliter hattının sağ kısmına ikinci bir 30 mikroliter montaj ortamı hattı uygulayın.
İnce tokmaklar kullanarak, bir bacağı orta bir damladaki çok tırnaklı plakadan dış tarafta yukarı veya aşağı yönde monte edilen 10 mikroliterlik montaj çubuğuna aktarın. Altı ila sekiz ayak monte edilene ve hizalanana kadar tekrarlayın ve bacakların üzerine ikinci bir kapak kapağı yerleştirin, böylece ikinci kapak ucu ilk kapak ucuna hafifçe dayanır.
