Drosophila Late Pupa Indirect Flight Muscle (IFM) Dissectie: een methode voor high-throughput weefselverzameling

- In de volwassen vlieg zijn de indirecte vliegspieren, of IFM's, de grootste spieren van de vlieg die de hele thorax overspannen. De IFM's orkestreren de karakteristieke hoogfrequente vleugelbewegingen in tweevleugelige vliegen, waaronder Drosophila. Twee tegengestelde spiervezelgroepen omvatten de IFM's.

Ten eerste bevinden de dorsale longitudinale spieren, of DMM's, zich langs het middenvlak van de thorax boven de darm en strekken zich uit van voor naar achter. Ten tweede strekken de dorsale ventrale spieren, of DVM's, zich uit van de bovenkant tot de onderkant van de thorax en worden geflankeerd door de TDT, of sprongspier. Beide spiergroepen zijn bevestigd aan de cuticula.

Ongeveer 48 uur na pupariumvorming, of APF, kunnen rijpende IFM's visueel worden geïdentificeerd met een eenvoudige dissectiemicroscoop. In het voorbeeldprotocol verzamelen we IFM's van poppen ouder dan 48 uur APF voor analyse met hoge doorvoer.

- Gebruik voor IFM-dissectie na 48 uur APF een licht bevochtigde kwast om de geënsceneerde poppen over te brengen op een strook dubbelzijdig plakband die op een microscoopschuif is gemonteerd. Oriënteer de poppen in een lijn, ventrale kant naar beneden en voorste naar de onderkant van de dia. Wanneer alle poppen zijn geplaatst, gebruikt u de tang om uit elkaar te plagen en de eerste popbehuizing boven de voorste spiracles te openen, en beweeg de pop voorzichtig naar de onderkant van de dia.

Bevrijd de pop uit de geopende behuizing en breng de pop onmiddellijk over op een druppel PBS op een tweede microscoopschuif. Wanneer alle poppen zijn bevrijd, gebruikt u een fijne schaar om de buik van de poppen weg te snijden van de thorax en duwt u de buiken in een aparte stapel. Wanneer alle thoraxen zijn verwijderd, gebruikt u een stuk tissuepapier om het grootste deel van de PBS en de stapel buiken te verwijderen.

Voeg een druppel verse gekoelde PBS toe aan de resterende thoraxen voordat u de schaar gebruikt om in één beweging van het hoofd langs de lengteas van het lichaam te snijden om de thorax in tweeën te verdelen. Wanneer alle poppen zijn ontleed, gebruikt u de nummer vijf tang om een van de hemisections te selecteren en plaatst u voorzichtig de uiteinden van één tang boven en onder het midden van de IFM's.

Houd het eerste paar tangen stil en gebruik een fijne schaar om het ene uiteinde van de IFM van de nagelriem en pezen af te snijden voordat u de pop 180 graden draait, zodat het andere uiteinde van de IFM vrij van de nagelriem en pezen kan worden gesneden. Gebruik de tang om de IFM-bundel van de thorax naar de rand van de PBS-bel over te brengen met behulp van waterspanning om de bundel op zijn plaats te houden.

Duw vervolgens het karkas naar de andere kant van de dia en ontleed de rest van de IFM's op dezelfde manier. Wanneer alle IFM's zijn verzameld, gebruikt u de nummer vijf tang om eventuele sprongspier- of cuticulafragmenten te verwijderen die mogelijk hun weg naar de monsters hebben gevonden. Gebruik vervolgens waterspanning om de ontleedde IFM's voorzichtig tussen een paar tangen vast te leggen en plaats de IFM's in een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met 250 microliter.