単一ワームPCR:ゲノムDNAを抽出し増幅する方法

- 単一ワームPCR分析の場合、雌雄同体ワームが遺伝的に同一の子孫を生み出す卵子を自己受精させ、したがって、改変株のコピーを保存することを可能にする。

チューブをマイナス80度で凍結してキューティクルまたは外層を壊す。サンプルを摂氏60度加えた値に加熱して、細胞内タンパク質を放出するワーム細胞を細胞のゲノムDNAと一緒に分解する。

その後、酵素を不活性化するために温度を摂氏95度に上げます。最後に、目的の領域の反応バッファー、dTUBE、フォワードおよびリバースプライマー 、taqポリメラーゼ、および水で構成されるPCRマスターミックスを持つチューブに細胞溶菌を加え、目的の最終体積に反応を持ち込みます。

次の例では、単一のF1ワームのゲノムDNAでCRISPR-Cas9編集イベントをスクリーニングするPCR手順を見ています。

- 産卵の1〜2日後、ワームの写真を使用して、7マイクロリットルの温かいリシスバッファーを含む個々のPCRストリップチューブキャップにF1sを移します。

次に、次のプログラムを用いてサーマルサイクラーで凍結したワームを溶かします。

21マイクロリットルのPCRマスターミックスをクリーンなPCRチューブに加え、4マイクロリットルのワームリシスチューブを加え、ピペットでよく混ぜます。

次に、製造元のガイドラインに従って PCRプログラムを実行します。