Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Voeg om te beginnen carbenicilline en een millimolar IPTG toe om kweekkolven met S basale media te controleren en te testen. Draai een buis met larven in groeifase één, ook wel L1-larven genoemd, gedurende een paar minuten. Verwijder nu het supernatant en plaats twee microliters L1's op een agarplaat. Plaats de plaat onder een ontleedmicroscoop en tel het aantal larven.
Voeg RNAi-bacteriën met een niet-specifieke RNAi-plasmide toe aan de controlekolf en bacteriën met gen-targeting RNAi aan de testkolf. De hoeveelheid toegevoegde bacteriën moet evenredig zijn met het aantal wormen.
Laat de larven groeien met continu schudden om een goede oxygenatie te garanderen. De larven voeden zich met de bacteriën. In de larve bindt het kleine storende RNA zich aan het complementaire mRNA dat door het beoogde gen wordt geproduceerd en remt het de eiwitexpressie. Onderzoek ten slotte de wormen op uw fenotype van belang.
In het voorbeeldprotocol behandelen we L1-larven met RNAi gericht op het daf-2-gen, in vloeibare cultuur.
- Voeg voor aanvang van de behandeling 207,45 milliliter S basale media met extra reagentia zoals beschreven in het begeleidende tekstprotocol toe aan een Fernbach kweekkolf van 2.800 milliliter. Voeg een eindconcentratie van 50 microgram per milliliter carbenicilline en 1 millimol IPTG toe en sluit de kolf met een membraanschroefdop.
Haal de L1's uit de incubator van 25 graden Celsius en breng ze over in buizen van 15 milliliter. Centrifugeer de L1's gedurende drie minuten op 1900 keer g. Verwijder na het spinnen het supernatant. Tel onder een microscoop de L1's per twee microliter en gemiddeld de aantallen verkregen uit ten minste negen druppels.
Voeg vervolgens 50.000 wormen toe voor de jonge wormencollectie en 100.000 wormen voor de oude wormencollectie in vier Fernbach-kweekkolven die in de vorige stap zijn bereid. Voeg vervolgens controle RNAi-bacteriën en RNAi-bacteriën toe voor het gen van belang proportioneel aan het aantal wormen.
Na het toevoegen van bacteriën, voltooi de wormcultuur met S-basaal om het totale volume op 300 milliliter te brengen. Incubeer de wormcultuur bij 25 graden Celsius in een schuddende incubator met 150 RPM tot het verzamelen.
