Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Beginnen Sie mit pelletierten Eiern, die durch Dasleicht werden, gravid adultwürmer Würmer. Stellen Sie sicher, dass jeder Schritt dieses Verfahrens steril durchgeführt wird, um eine Kontamination der kultivierten Zellen zu vermeiden. Setzen Sie das Pellet in einer Lösung von Chitinase aus, einem Enzym, das Chitin abbaut -- ein großes Polysaccharid, das eine strukturelle Komponente der Eihülle ist.
Nach einer geeigneten Verdauungsphase Zentrifugieren Sie die Eier sanft und ersetzen Sie den Überstand durch das Zellkulturmedium, um die Verdauung zu stoppen. Dann übergeben Sie die Embryonen durch eine 18-Spur-Nadel, um einzelne Zellen mechanisch zu trennen. Als nächstes filtern Sie die Lösung, um Schmutz aus der Eischale oder ungetrennte Zellklumpen zu entfernen.
Im Beispielprotokoll bereiten wir embryonale Zellen für die morphologische Differenzierung und Analyse in vitro vor.
- Während der Arbeit unter einer laminaren Durchflusshaube, um die Einführung einer bakteriellen Kontamination zu vermeiden, setzen Sie die pelleted Eier in einem Milliliter von zwei Milligramm pro Milliliter Chitinase aus und übertragen Sie sie in eine frische 15 Milliliter konische Röhre. Schaukeln Sie die Röhre für 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur, abhängig von der Frische des Enzyms. Wenn etwa 80% der Eierschalen verdaut werden, zentrieren Sie die Eier bei 900 g für drei Minuten.
Nach sorgfältiger Entfernung des Überstandes drei Milliliter L15 Medium hinzufügen. Die Eier in eine Platte mit sechs Zentimeterdurchmessern geben und mit einer 10-Milliliter-Sterilspritze mit 18-Spur-Nadel mit der manuellen Dissoziation beginnen. Um den Grad der Dissoziation zu überwachen, legen Sie einen Tropfen Suspension in eine frische Petrischale und sehen Sie unter einem Mikroskop. Weiter, bis ca. 80% der Zellen getrennt sind.
Um Zellklumpen zu entfernen, Unverdaute Eier und geschlüpfte Larven filtern die Suspension vorsichtig durch einen Fünf-Mikron-Filter und führen weitere vier bis fünf Milliliter L15 mittel durch den Filter, um die Zellen zurückzugewinnen. Um die Zellen nach der Zentrifugierung des Filtrats bei 900 g für drei Minuten zu kultiieren, setzen Sie die Zellen in vollständiger L15-Medium wieder auf. Platten einen Milliliter pro Brunnen, und lagern Sie Platten in einer feuchten versiegelten Kammer bei 20 Grad Celsius in der Umgebungsluft.
