Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- Begynn med pelleterte egg som ble isolert ved bleking av gravide voksne ormer. Sørg for at hvert trinn i denne prosedyren utføres sterilt for å unngå forurensning av de dyrkede cellene. Suspender pellet i en løsning av chitinase, et enzym som bryter ned chitin - et stort polysakkarid som er en strukturell komponent i eggeskallet.
Etter en passende fordøyelsesperiode sentrifugerer du eggene forsiktig og erstatter supernatanten med cellekulturmediet for å stoppe fordøyelsen. Deretter passerer du embryoene gjennom en 18-gauge nål for å mekanisk skille individuelle celler. Deretter filtrerer du løsningen for å fjerne rusk fra eggeskallet eller usette celleklumper. Plate cellene i en kulturrett på et glassdeksel slip belagt med peanøtt agglutinin - et lectin som hjelper cellene festes til dekselet slip ved å binde celleoverflate karbohydrater.
I eksempelprotokollen vil vi forberede embryonale celler for in vitro morfologisk differensiering og analyse.
- Mens du arbeider under en laminær strømningshette for å unngå å introdusere bakteriell forurensning, resuspend pelleted egg i en milliliter av to milligram per milliliter chitinase og overføre dem til en frisk 15 milliliter konisk tube. Rock røret i 10 til 30 minutter ved romtemperatur, avhengig av friskheten av enzymet. Når ca 80% av eggeskallene fordøyes, sentriger eggene på 900 g i tre minutter.
Etter forsiktig fjerning av supernatanten, tilsett tre milliliter L15 medium. Overfør eggene til en seks centimeter diameter plate og begynn manuell dissosiasjon ved hjelp av en 10 milliliter steril sprøyte med en 18-gauge nål. For å overvåke graden av dissosiasjon, plasser en dråpe suspensjon i en frisk Petri-tallerken og se under et mikroskop. Fortsett til ca. 80% av cellene er dissosiert.
For å fjerne celleklumper, ufordøyde egg, og klekkede larver, filtrer forsiktig suspensjonen gjennom et fem-mikron filter og kjør ytterligere fire til fem milliliter L15 medium gjennom filteret for å gjenopprette cellene. For å dyrke cellene etter sentrifugering av filtratet på 900 g i tre minutter, re-suspendere cellene i komplett L15 medium. Plate en milliliter per brønn, og lagre plater i et fuktig forseglet kammer ved 20 grader Celsius i omgivelsesluft.
