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Encyclopedia of Experiments: Cancer Research

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Preparazione del campione per la metabolomica

 
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Preparazione del campione per la metabolomica: un metodo per preparare campioni di cellule per la profilazione dei metaboliti

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La metabolomica è lo studio per identificare e quantificare i metaboliti presenti all'interno delle cellule. Per preparare il campione, iniziare seminando cellule tumorali del seno insieme a un mezzo di crescita in due piastre etichettate come test e controllo. Incubare per tre giorni a 37 gradi Celsius. Ora, rimuovere il mezzo e aggiungere il mezzo fresco con estradiolo nella piastra di prova e mezzo semplice nella piastra di controllo.

L'estradiolo si lega al recettore degli estrogeni alfa nelle cellule tumorali del seno per indurre determinate espressioni, causando un cambiamento nella composizione del metabolita. Incubare le piastre per la durata desiderata. Sostituire il mezzo con salina tamponata con fosfato ghiacciato o PBS per lavare le cellule e quindi aggiungere acetone ghiacciato. I reagenti ghiacciati fermano l'azione delle proteasi e quindi prevengono la degradazione proteica.

Ora usa un raschietto per staccare le cellule dalle piastre e trasferirle in tubi con l'aiuto di una pipetta. Prendi 20 microlitri di questa sospensione cellulare su un emocitometro e conta il numero di cellule. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius fino a quando non vengono utilizzati per ulteriori analisi. Nel seguente protocollo, prepariamo campioni da celle MCF-7 per la gascromatografia e la spettrometria di massa.

Utilizzando celle MCF-7 coltivate secondo il protocollo di testo, aggiungere cinque millilitri di ghiaccio freddo 1x PBS alla piastra. Quindi inclinare la piastra più volte prima di rimuovere il PBS. Ripetere altre due volte rimuovendo il maggior PBS possibile dopo l'ultimo lavaggio. Aggiungere 750 microlitri di acetone prechilled ad ogni piastra e raschiare le cellule, quindi combinare le cellule da due piastre in un tubo a due millilitri sul ghiaccio.

Per contare le cellule per la normalizzazione, per ogni trattamento, utilizzare due piastre extra per la quantificazione cellulare. Quindi per staccare le cellule dalle piastre aggiungere 2 millilitri di tampone HE e incubare per cinque minuti. Mescolare accuratamente le celle pipettando nel tampone HE.

Quindi utilizzare 20 microlitri della soluzione cellulare in un emocitometro per contare il numero di cellulare al microscopio. Conservare i campioni a -80 gradi Celsius prima di utilizzare l'analisi della spettrometria di massa della gascromatografia per identificare e quantificare i metaboliti. Eseguire analisi integrative in base al protocollo di testo.

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