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JoVE Encyclopedia of Experiments
Encyclopedia of Experiments: Cancer Research

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메타볼로믹스에 대한 샘플 준비

 
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메타볼로믹스에 대한 샘플 준비: 대사산물 프로파일링을 위한 세포 샘플을 준비하는 방법

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메타볼로믹스는 세포 내에 존재하는 대사산물을 식별하고 정량화하는 연구입니다. 견본을 준비하기 위하여는, 시험 및 통제로 표지된 2개의 판에 있는 성장 매체와 더불어 유방암 세포를 파종하는 것으로 시작합니다. 섭씨 37도에서 3일간 배양합니다. 이제, 매체를 제거하고 제어 판에 에스트라디올과 일반 배지로 신선한 배지를 추가한다.

estradiol은 특정 발현을 유도하기 위해 유방암 세포에서 에스트로겐 수용체 알파에 결합하여 대사 산물 조성물의 변화를 일으킨다. 원하는 지속 시간 동안 플레이트를 배양합니다. 매체를 얼음 냉인 인산염 완충식식염 또는 PBS로 교체하여 세포를 세척한 다음 얼음 차가운 아세톤을 추가합니다. 얼음 차가운 시약은 프로테아제의 작용을 멈추고 따라서 단백질 분해를 방지합니다.

이제 스크레이퍼를 사용하여 플레이트에서 세포를 분리하고 파이펫의 도움으로 튜브로 옮겨넣습니다. 이 세포 현탁액의 20 마이크로리터를 혈전계에 가져 가서 세포 수를 계산하십시오. 추가 분석에 사용될 때까지 샘플을 영하 80도에 저장합니다. 다음 프로토콜에서는 가스 크로마토그래피 및 질량 분광법을 위해 MCF-7 세포로부터 샘플을 준비합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 배양된 MCF-7 세포를 사용하여 접시에 얼음 차가운 1x PBS 5 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 PBS를 제거하기 전에 접시를 여러 번 기울입니다. 마지막 세척 후 가능한 한 많은 PBS를 제거 두 번 더 반복합니다. 각 접시에 750 마이크로리터를 넣고 세포를 긁어낸 다음 두 개의 플레이트에서 얼음에 있는 2밀리리터 튜브로 세포를 결합합니다.

정규화를 위해 세포를 계산하려면 각 치료에 대해 세포 정량화에 두 개의 추가 플레이트를 사용합니다. 그런 다음 플레이트에서 세포를 분리하려면 HE 버퍼 2 밀리리터를 추가하고 5 분 동안 배양합니다. HE 버퍼에서 파이펫팅하여 셀을 완전히 섞습니다.

그런 다음 혈종계에서 세포 용액의 20 마이크로리터를 사용하여 현미경으로 세포 수를 계산합니다. 가스 크로마토그래피 질량 분광 분석을 사용하기 전에 음수 80도에서 샘플을 저장하여 대사 산물을 식별하고 정량화합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 통합 분석을 수행합니다.

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