Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Metabolomics, hücrelerde bulunan metabolitleri tanımlamak ve ölçmek için yapılan çalışmadır. Örneği hazırlamak için, meme kanseri hücrelerinin tohumlama ile birlikte test ve kontrol olarak etiketlenmiş iki tabakta büyüme ortamı ile başlayın. 37 santigrat derecede üç gün kuluçkaya yaslanın. Şimdi, ortamı çıkarın ve test plakasına estradiol ve kontrol plakasına düz orta ile taze orta ekleyin.
Estradiol, belirli ifadeleri teşvik etmek için meme kanseri hücrelerindeki östrojen reseptör alfasına bağlanır ve metabolit bileşiminde bir değişikliğe neden olabilir. Plakaları istediğiniz süre boyunca kuluçkaya yatırın. Hücreleri yıkamak için ortamı buz gibi fosfat tamponlu salin veya PBS ile değiştirin ve ardından buz gibi aseton ekleyin. Buz gibi reaktifler proteazların eylemini durdurur ve böylece protein bozulmasını önler.
Şimdi hücreleri plakalardan ayırmak için bir kazıyıcı kullanın ve pipet yardımıyla tüplere aktarın. Bu hücre süspansiyonunun 20 mikrolitresini bir hemositometreye alın ve hücre sayısını sayın. Numuneleri daha fazla analiz için kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Aşağıdaki protokolde, MCF-7 hücrelerinden gaz kromatografisi ve kütle spektrometresi için örnekler hazırlıyoruz.
Metin protokolüne göre kültürlenmiş MCF-7 hücrelerini kullanarak, plakaya beş mililitre buz soğuk 1x PBS ekleyin. Ardından PBS'yi çıkarmadan önce plakayı birkaç kez eğin. Son yıkamadan sonra mümkün olduğunca çok PBS çıkararak iki kez daha tekrarlayın. Her plakaya 750 mikrolitre ön şilinli aseton ekleyin ve hücreleri kazıyın, ardından iki plakadan hücreleri buz üzerinde iki mililitrelik bir tüpte birleştirin.
Hücreleri normalleştirme için saymak için, her tedavi için hücre nicelemesi için iki ekstra plaka kullanın. Daha sonra hücreleri plakalardan ayırmak için 2 mililitre HE tamponu ekleyin ve beş dakika kuluçkaya yatırın. HE tamponunda pipetleme yaparak hücreleri iyice karıştırın.
Daha sonra hücre numarasını mikroskop altında saymak için hemositometrede hücre çözeltisinin 20 mikrolitresini kullanın. Metabolitleri tanımlamak ve ölçmek için gaz kromatografisi kütle spektrometresi analizini kullanmadan önce numuneleri negatif 80 santigrat derecede saklayın. Metin protokolüne göre bütünleştirici analiz gerçekleştirin.
