Un modelo de tumor vesical ortotópica y la Evaluación de tratamiento intravesical SARNA

Presentamos un método para establecer un modelo ortotópico de tumor de vejiga en ratones inmunocomprometidos. El tratamiento de estos tumores con ARN bicatenario pequeño administrado por vía intravascular y el seguimiento de los tumores con ecografía vesical e imágenes de bioluminiscencia. Se induce anestesia general con isof vaporizado, flúor y se aplica ungüento oftálmico estéril.

A continuación, se coloca el ratón en posición supina y se mantiene la anestesia con flúor a través del cono nasal. A continuación, se debe cateterizar al ratón. Utilizamos un catéter intravenoso de calibre 24 con el estilete de la aguja retirado.

El cateterismo suele ser el paso más difícil e impredecible del protocolo. Una amplia lubricación con jalea KY y la técnica correcta son claves para el éxito del cateterismo. Aquí se muestra el área de la vulva del ratón.

La uretra se encuentra justo debajo de los pliegues de la vulva. Después de lubricar, las pinzas del catéter se utilizan para agarrar y estabilizar suavemente la vulva y la uretra. Inicialmente, se usaba un ángulo más pronunciado de 45 grados para canular la uretra, pero una vez en la uretra, se toma un ángulo más poco profundo para pasar suavemente a la vejiga.

Mostraremos este proceso aquí. Una vez más, la presión pélvica suave para enderezar la uretra a menudo puede ayudar y se debe tener cuidado para evitar empujar demasiado fuerte contra la resistencia, ya que esto puede provocar la perforación de la uretra o la vejiga. La orina que se ve aquí dentro del catéter confirma esta ubicación dentro de la luz de la vejiga.

Luego, la orina dentro del catéter se extrae con la aguja del estilete y el catéter se deja en su lugar. Aproximadamente cinco milímetros de catéter deben permanecer visibles fuera de la uretra para que la punta del catéter permanezca en la luz de la vejiga y no contra la pared de la vejiga. Si el catéter se coloca demasiado lejos en el catéter, la punta puede incrustarse en la pared de la vejiga e impedir las inyecciones.

Para todas las inyecciones posteriores. Se coloca una jeringa cargada en la aguja del estilete a través del catéter. Esto permite la inyección de volúmenes precisos al eliminar el espacio muerto dentro del catéter y hace que los cateterismos repetidos sean innecesarios para crear una lesión por quemadura en la pared de la vejiga.

Se inyectan 10 microlitros de nitrato de plata 0,5 molar y se dejan reposar durante 10 segundos. El nitrato de plata puede formar un precipitado blanco con orina residual dentro de la vejiga. Este precipitado y cualquier solución restante se retiran del catéter.

A continuación, procedemos a lavar la vejiga con 100 microlitros de agua estéril cuatro veces, cada vez eliminando el líquido de la luz del catéter. Después de este primer lavado, el precipitado blanco todavía es visible dentro del catéter, pero con cada lavado, el líquido se volverá más claro. Se utiliza una corbata de seda de cuatro pulgadas para ocluir la uretra y ahora estamos listos para inyectar las células cancerosas.

Las células se cargan en una jeringa conectada a la aguja del estilete y las células se inyectan en la vejiga. Se retira el catéter y la uretra permanecerá atada con el ratón bajo anestesia durante dos horas. A intervalos preestablecidos, se controla la progresión del tumor.

Utilizando imágenes de bioluminiscencia in vivo, primero se inyecta a los ratones Lucifer y sustrato mediante inyección intraperitoneal. Después de establecer la anestesia general con isof fluor vaporizado, los ratones se colocan en posición supina dentro de la máquina de ivus. La bioluminiscencia se mide en unidades de fotones por segundo.

La presencia de células KU siete dentro de las vejigas de ratón es fácilmente evidente y la intensidad bioluminiscente se puede seguir a lo largo del tiempo. La presencia y progresión de los tumores de vejiga también se pueden controlar con ecografías. Después de inducir la anestesia general con isof vaporizado, se aplica flúor y ungüento oftálmico estéril.

El ratón se coloca en posición supina sobre la mesa de ultrasonidos. La anestesia de mantenimiento se logra con isofof, flúor a través del cono nasal. Las patas traseras del ratón se pueden asegurar a la mesa para evitar el movimiento excesivo del cuerpo mientras se manipula la sonda de ultrasonido.

Una vez completado, se aplica un gel de ultrasonido en la parte de la línea media de la pelvis del animal. Después de aplicar un gel, se asegura una sonda de 40 megahercios al dispositivo de sujeción y se baja lentamente sobre el cuerpo del animal. La vejiga es fácilmente visible como una estructura hipoecoica redonda en la línea media.

Si el animal no ha sufrido una irritación significativa antes de la anestesia, es habitual que la vejiga ya esté distendida y hemos considerado innecesario cateterizar al ratón para conseguir la distensión vesical. Aquí se pueden obtener imágenes transversales y longitudinales. Un tumor se ve fácilmente dentro de la luz de la vejiga.

Si se encuentra un tumor, las imágenes se pueden guardar para medir las dimensiones del tumor. Después del establecimiento del tumor de vejiga, los ratones son tratados por vía intravesical con pequeño ARN bicatenario formulado en nanopartículas lipídicas. Se establece anestesia general y se vuelve a aplicar pomada oftálmica.

A continuación, se coloca el ratón en posición supina y se realiza un cateterismo uretral. Como describimos anteriormente, se utiliza una sutura de seda de cuatro ohs para ocluir la uretra alrededor del catéter. Por lo general, se atan dos nudos como se muestra aquí.

Se utiliza una jeringa vacía cargada en una aguja de estilete para evacuar la vejiga por completo y se instilan 50 microlitros de ARN bicatenario pequeño por vía intravesical para una dosis total de tres miligramos por kilogramo. A continuación, se retiran la aguja y el catéter.

El ratón permanecerá anestesiado con la uretra ocluida durante un total de dos horas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de un método para crear un modelo ortotópico de tumor de vejiga de ratón que monitorea el tumor con imágenes de bioluminiscencia y ultrasonido, y trata el tumor con ARN pequeño administrado por vía intravesical. Hay algunos matices en la técnica, que requiere algo de práctica, especialmente con el cateterismo, pero en general, es un protocolo que debería ser fácilmente replicable.

Hemos tenido un buen éxito en la plantación de tumores de vejiga en ratones, y los efectos del tratamiento con el ARN pequeño son muy prometedores. Sin embargo, lo más emocionante de este protocolo es que, si bien tratamos a los ratones con ARN pequeño, la misma técnica se puede usar para probar cualquier terapia intravesical para el cáncer de vejiga.