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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Utilizzo di un emacitometro per contare le cellule
 
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Utilizzo di un emacitometro per contare le cellule

Overview

Molti esperimenti biomedici richiedono la manipolazione di una quantità nota di cellule, al fine di ottenere dati accurati, riproducibili e statisticamente rilevanti. Pertanto, imparare a contare le cellule è una tecnica particolarmente essenziale per qualsiasi scienziato biomedico di successo. Il modo più comune per contare le cellule è usare un emacitometro - uno strumento che porta due griglie incise al laser, che aiutano nell'enumerazione di una cella aliquota sotto un semplice microscopio ottico. Questi dati possono quindi essere utilizzati per estrapolare il numero di cellule nel campione sperimentale.

Questo video mostrerà come: regolare la concentrazione del campione sperimentale in modo da non cercare di contare troppe – o troppo poche – cellule; come usare un emacitometro per contare una piccola aliquota (~10 μl) delle cellule; come determinare quale quadrante della griglia laser dell'emacitometro utilizzare per il conteggio; come calcolare il numero totale di cellule nel campione sperimentale, a seconda del quadrante utilizzato; e come determinare la vitalità della popolazione cellulare sperimentale usando l'esclusione blu di tripano. Inoltre, vengono discusse anche varie situazioni sperimentali per le quali è necessaria una determinazione affidabile e accurata dei numeri di cella, incluso un esempio utilizzando un contatore di celle automatizzato.

Procedure

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Il conteggio delle cellule è un passo importante in molti saggi basati su cellule per determinare il numero e la vitalità delle cellule. In generale, l'obiettivo del conteggio è capire quanto un campione di una concentrazione di cellule sconosciute deve essere diluito per un ulteriore utilizzo. Lo strumento di laboratorio più comune per il conteggio delle cellule è l'emacitometro.

L'emacitometro è uno strumento di conteggio che è stato originariamente creato per contare le cellule del sangue. Al centro dell'emacitometro ci sono due camere di conteggio, su cui si può trovare una griglia incisa al laser.

La griglia è composta da 9 quadranti principali. I quattro quadranti angolari sono ulteriormente divisi in 16 quadranti più piccoli. Il quadrante centrale è diviso in 25 di questi quadranti più piccoli, ognuno dei quali è ulteriormente diviso in 16 micro-quadranti.

All'estremità di ogni camera ci sono le porte di introduzione del campione, in cui viene erogato il campione di cella da contare.

Su entrambi i lati delle camere di conteggio si trovano i supporti di montaggio antiscivolo di copertura, su cui poggia il coperchio in quarzo, di solito circa 0,1 mm sopra la camera di conteggio.

Poiché l'area di ogni grande quadrato è di 1 mm2, il volume contenuto da ogni grande quadrato è di 0,1 mm3 o 1/10.000 di un ml.

Prima di contare, prenditi sempre un momento per usare etanolo e un kimwipe per pulire e asciugare via qualsiasi lanugine, impronte digitali o filigrane dal coperchio e dalla camera di conteggio.

Quindi aggiungere con attenzione una piccola quantità di acqua a ciascuno dei supporti di montaggio del coverslip, la tensione superficiale dell'acqua manterrà il coverslip in posizione.

Ora triturare delicatamente la sospensione cellulare, o pipettarla su e giù, per rimuovere eventuali grumi cellulari. Utilizzare una micropipetta per aspirare circa 10 μl della sospensione e quindi caricare una delle porte di introduzione con il campione. La soluzione verrà aspirata nella camera di conteggio per azione capillare e dovrebbe coprire l'intera griglia.

Mentre le celle si stanno depositando, selezionare l'obiettivo. Quindi caricare l'emacitometro sul palco.

Quindi visualizzare le cellule al microscopio. Se ci sono meno di 5 celle in ciascuno dei grandi quadranti, potrebbe essere necessario ruotare nuovamente il campione verso il basso e risuscievole il pellet in un volume più piccolo. Se le cellule si sovrappongono l'una all'altra o sono semplicemente troppo dense per distinguersi facilmente l'una dall'altra, potrebbe essere necessario diluire il campione in un volume maggiore di soluzione. Assicurati di tenere traccia del fattore con cui stai diluendo le tue cellule. Ne avrai bisogno in un calcolo successivo.

Ora è il momento di contare le celle!

Come abbiamo detto prima, la camera di conteggio è coperta da una griglia incisa al laser. Le linee dei quadranti rendono più facile tenere traccia delle celle che stai contando. Scegliere il quadrante delle dimensioni per il conteggio in base alla densità delle celle nel campione. Ad esempio, se è presente un numero basso di celle, contare tutte le celle in uno dei quadranti angolari. Per i campioni con una quantità media di cellule, scegliere uno dei 16 quadranti più piccoli. Se c'è una densità molto alta di celle, conta le celle in uno dei 25 quadranti centrali. Indipendentemente dal quadrante scelto o dalla densità del campione di cellule, contare almeno 20-50 celle per quandrant.

Non tutte le celle cadranno ordinatamente all'interno dei quadranti. Puoi contare le celle che toccano le linee superiore e sinistra, ma ignora quelle che toccano quelle in basso o a destra. Per ottenere il conteggio più accurato, utilizzare un contatore di celle per tenere traccia delle celle e prendere la media del numero di celle in 4 quadranti della stessa dimensione.

Per calcolare il numero di cellule in un volume di 1 ml, moltiplicare il numero di cellule contate per 10.000, perché, come accennato in precedenza, ogni grande quadrato sulla griglia è 1/10.000 di un ml. Se hai contato uno di questi quadranti più grandi, moltiplica semplicemente questo numero 1. Se hai contato uno dei quadrati più piccoli in uno dei quadranti angolari, moltiplica questo numero per 16. Se hai contato tutte le celle in uno dei 25 quadranti centrali, moltiplica questo numero per 25. Se ti è capitato di diluire la sospensione cellulare prima di caricare l'emacyotmetro, dovrai anche moltiplicare per il fattore di diluizione.

Quindi, per calcolare il numero di cellule in 1 ml di questo campione, moltiplichiamo le 20 cellule in questo quadrante centrale per 104 e 25 per ottenere un totale di 5 x 106 cellule in 1 ml del campione.

Ora che conosciamo il numero totale di cellule in 1 ml del campione, dobbiamo moltiplicare questo numero per il volume totale della nostra soluzione. Quindi, ad esempio, se abbiamo 5 x 106 cellule in 1 ml, quindi in 2 ml, avremo un totale di 1 x 107 cellule.

Quindi, per evitare errori di conteggio errato, distribuzione non uniforme delle celle o errori di pipettaggio, caricare l'altro lato della camera e contare il campione di cella una seconda volta.

Contare le cellule al microscopio è anche un ottimo momento per valutare la vitalità delle cellule nel campione. Il tripano blu, una macchia vitale, viene spesso miscelato con il campione prima di essere caricato nell'emacitometro per questo scopo.

Le cellule vive escludono questo colorante, perché le cellule viventi sono molto selettive su ciò che permettono attraverso le loro membrane. Una cellula morta, tuttavia, non ha una membrana intatta, che consente al tripano blu di passare attraverso e macchiare il citoplasma.

Per verificare la vitalità del campione cellulare, diluire un'aliquota della sospensione cellulare in tripano blu, quindi caricare il campione colorato di tripano blu proprio come il normale campione cellulare. Sotto il contrasto di fase, le cellule vive appariranno luminose e dorate e dovrebbero essere contate; non contare nessuna delle cellule blu opache, morte.

Calcola il numero di celle come prima, questa volta moltiplicando il numero finale per il fattore di diluizione blu del tripano. Quindi, se il nostro campione rappresentativo originale fosse stato prima diluito in tripano blu, avremmo poi moltiplicato il nostro numero totale di cellule per la nostra diluizione blu di tripano 1:10, per un totale di 1x108 cellule nel nostro campione.

Quando hai finito di contare, ricordati di pulire il coperchio e la camera di conteggio!

Ora che sei un professionista del conteggio delle cellule, parliamo di alcuni dei motivi per cui potresti aver bisogno di sapere quante cellule hai in un particolare esperimento.

Dopo aver isolato le cellule da un tessuto normale o sperimentale, è importante sapere quante cellule hai recuperato. Qui i ricercatori vorranno sapere quanti splenociti, o cellule della milza, hanno isolato da questa milza di topo.

Quando si esegue un esperimento per vedere come reagiscono due diverse popolazioni cellulari, è importante sapere quante di ogni tipo di cellula si stanno mescolando insieme, come in questo esperimento di co-coltura con cellule B e T.

Vorrai sapere quante cellule hai per molti altri tipi di saggi basati su cellule. Qui viene impostato un test ELISPOT per determinare il numero di cellule in un campione che secernerà IFNγ, una proteina infiammatoria, in risposta al virus del papilloma umano.

Quando si esegue un esperimento in cui l'mRNA deve essere estratto, o isolato, dalle cellule di interesse, è importante sapere con quante chiamate si sta iniziando, al fine di acquisire una quantità sufficiente di mRNA per l'esperimento.

L'emacitometro è uno strumento economico e relativamente facile da usare per contare le celle, ma può essere noioso e ha il potenziale per l'errore umano.

Lo Scepter Handheld Automatic Counter è, come suggerisce il nome, un dispositivo di conteggio portatile che ha una precisione di conteggio migliorata rispetto all'emacitometro e che può discriminare sia la dimensione che il volume delle cellule in un campione di cellule.

Il contatore di celle automatizzato TC10 valuta sia il numero di celle che la vitalità, calcola automaticamente il numero di celle totali nel campione e consente di visualizzare le celle anche nella schermata di lettura.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE al conteggio delle cellule. In questo video abbiamo esaminato: cos'è un emacitometro, come contare le cellule e determinare la vitalità cellulare e alcuni motivi diversi per cui potrebbe essere necessario contare le cellule. Grazie per aver guardato e ricordati di non contare le celle blu!

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