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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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SDS-PAGE로 단백질 분리

Overview

나트륨 도데딜 황파테 폴리 아크릴아미드 젤 전기 포근, 또는 SDS-PAGE, 그들의 크기와 다른 아무것도에 따라 단백질의 혼합물을 분리하기 위한 널리 사용되는 기술이다. 성안 세제인 SDS는 선형화된 단백질의 길이에 걸쳐 균일한 전하를 생성하는 데 사용됩니다. 먼저 폴리아크릴아미드로 만든 젤에 넣은 다음 젤에 전기장을 적용하면 SDS 코팅 단백질이 분리됩니다. 전기장은 구동력역할을 하며, SDS 코팅 단백질을 작은 단백질보다 더 느리게 움직이는 더 큰 단백질을 가진 양극쪽으로 그립니다. 크기별로 단백질을 식별하기 위해 알려진 크기의 단백질 표준은 샘플과 함께 로드되고 동일한 조건에서 실행됩니다.

이 비디오는 먼저 그 뒤에 이론을 설명하고 나중에 단계별 절차를 보여 줌으로써 SDS-PAGE에 대한 소개를 제공합니다. 겔에 적용된 폴리아크릴아미드 농도 및 전압과 같은 다양한 실험 파라미터가 논의된다. 쿠마시와 은 얼룩과 같은 다운스트림 염색 방법이 도입되고, 2D 젤 전기포고와 같은 방법의 변형이 제시된다.

Procedure

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SDS-PAGE는 많은 연구자들이 단백질 혼합물을 크기별로 분리하는 데 사용하는 기술입니다. 이 기술의 성공적인 완성은 면역 blotting과 같은 많은 단백질 분석 방법에 필수적인 첫 번째 단계입니다. 그 자체로 단백질 크기와 순도를 평가하는 데 유용한 도구입니다.

SDS-PAGE 기술을 이해하려면 먼저 기본 구성 요소를 이해해야 합니다. SDS-PAGE는 나트륨 도데실 황산염 폴리 아크릴아미드 젤 전기 포레시스를 의미합니다. 나트륨 -도데실린 설페이트, 이것의 첫 번째 부분, 또는 "SDS", 음이온 세제입니다. 즉, 순 음전하와 중립 전하가 있는 긴 소수성 사슬을 가진 친성군으로 구성된다.

소수성 사슬은 단백질 1그램당 1.4그램의 SDS 속도로 질량에 비례하여 단백질을 담요로 덮습니다. 이것은 전기장에서 크기 구동 분리에 필요한 원동력으로 단백질을 제공합니다.

폴리 아크릴아미드 젤 전기포레시스는 폴리아크릴아미드로 만든 하이드로겔을 활용합니다. 폴리아크릴아미드는 단백질이 움직일 수 있는 매우 규칙적인 매트릭스를 형성하는 폴리머입니다. 젤이 집중될수록 전기장에 노출되면 단백질이 통과할수록 속도가 느립니다. 물체 운동에 영향을 미치기 위해 공간적으로 균일한 전기장을 사용하는 공정을 전기전주로 알려져 있다.

SDS-PAGE는 배양, 조직, 혈액, 소변 및 효모의 세포를 포함하여 많은 다른 근원에서 분리된 단백질에 수행됩니다.

이러한 다양한 소스에서 단백질먼저 균질화 및 원심 분리를 포함 하 여 기술을 사용 하 여 다른 세포 구성 요소에서 분리 해야 합니다., 종종 lysis 버퍼의 사용 다음.

단백질이 고립되면, 그 농도는 종종 비신천산, 또는 BCA, 색도 분석의 알부민 표준에 샘플의 단백질의 양을 비교하여, 샘플의 동등한 적재를 보장하기 위해 측정된다.

기억해야 할 중요한 단계는 로딩 버퍼를 추가하는 것입니다. 로딩 버퍼에는 3개의 주요 기능이 있습니다. 첫째, SDS와 추가 환원 제 덕분에 단백질을 변성하여 기본적으로 복잡한 단백질 구조를 아미노산의 선형 체인으로 전환한다는 것을 의미합니다. 둘째, 글리세린이 함유되어 있어 젤 우물에 적재될 때 시료가 부유하지 않도록 합니다. 그리고 마지막으로, 대부분의 상용 적재 버퍼는 전기 포근 단계의 진행상황을 측정하기 위해 추적될 수 있는 브로모페놀 블루와 같은 염료를 포함한다.

로딩 버퍼를 추가한 후 샘플을 혼합한 다음 5분 동안 끓여야 합니다. 이를 통해 단백질의 강력한 디 황화물 결합은 베타-메르카토에탄올과 같은 환원제의 도움으로 깨질 수 있습니다. 모든 이황화물 결합이 깨지면 SDS가 단백질을 더 균등하게 코팅 할 수 있습니다.

다음으로, 샘플은 신속하게 아래로 분사하고 전기 전광을 위한 젤 시스템에 로드될 준비가 됩니다.

샘플을 로드하기 전에 젤 시스템을 먼저 조립해야 합니다. 이것은 폴리 아크릴아미드 젤의 구입 또는 제조로 시작됩니다. 아크릴리제는 신경 독성이 있고 뇌 손상을 일으킬 수 있기 때문에 미리 만들어진 젤은 점점 더 인기를 끌고 있습니다. 젤 카세트에는 샘플을 적재하는 데 사용되는 우물이 포함되어 있습니다.

젤이 제자리에 고정되면 내부 및 외부 챔버는 젤을 만드는 데 사용되는 동일한 이온 농도를 포함하는 버퍼로 채워집니다. 이것은 음극에서 젤을 통과하고 양극으로 원활하게 통과하는 전기 회로를 만듭니다.

다음으로, 분자량 사다리는 전형적으로 젤에 적재되고, 그 다음에 는 견본이 뒤따릅니다. 젤이 실행되면 사다리가 퍼지고 알려진 크기의 눈에 보이는 단백질 밴드를 만듭니다. 마지막 단계에서, 이 밴드는 각 단백질의 크기를 계산하는 데 사용할 수 있습니다.

모든 시료가 로드되면 젤 박스의 양수 및 음수 단자는 장시간 일정한 전압을 유지할 수 있는 전원에 연결됩니다. 젤은 전형적으로 전체 샘플이 "스태킹 젤"이라고 불리는 젤 부위에 들어갈 때까지 약 60V에서 시작됩니다. 이어서, 겔의 크기와 농도 및 관심 있는 단백질의 크기에 따라 전압이 약 200V로 30분에서 1시간 동안 증가한다.

전기 전도가 완료되면 카세트가 제거되고 열리면 젤을 노출합니다. 젤은 그 때 겔 내의 단백질 밴드를 시각화하기 위하여 쿠마시 블루 또는 은 얼룩과 같은 전형적인 단백질 얼룩으로 얼룩질 수 있습니다. Coomassie 얼룩은 단백질의 50 나노 그램만큼 작은 밴드를 감지 할 수 있습니다, 실버 얼룩은 단백질의 작은 1 나노 그램밴드를 감지 할 수있는 반면.

2차원 겔 전기포고증에서 샘플은 젤에 대한 두 가지 별도 특성으로 구분되며, 한 번에 1차원이 형성됩니다. 첫째, 샘플은 국소화된 pH 그라데이션 스트립의 등산 지점에 따라 적재되고 배열됩니다. 스트립의 단백질은 변성되고 신선한 젤 용액으로 제자리에 고정되는 전형적인 폴리 아크라이알라미드 젤 위에 놓입니다. 그런 다음 두 번째 차원 분리는 SDS-PAGE에 의해 수행됩니다.

동전 적 초점 2-D 젤 전기 포진에 대 한 유일한 옵션, 그것은 가장 일반적인. 2차원 젤 전기전광은 단백질 복합체 및 하위 세포조직에 대한 통찰력을 제공하는 귀중한 도구입니다.

젤을 실행 한 후, 매우 일반적인 다음 단계는 분석을 위해 PVDF 또는 나일론으로 만든 막에 젤에서 단백질을 전송하는 것입니다. 그런 다음 특정 항체를 사용하여 막을 조사하고 관심있는 단백질을 찾을 수 있습니다. 여기에 표시된 전형적인 면역 블롯 결과 연구원은 3 개의 다른 신호 증폭 기술을 사용하여 여러 일련 희석을 통해 Pit-1 단백질의 존재를 가장 잘 보여주는 지 결정하는 것입니다.

SDS-PAGE를 사용하여 단백질 분리에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이제 이 강력한 기술을 사용하여 크기별로 단백질을 해결하는 데 관련된 단계를 이해해야 합니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!

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