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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Overview

Um ensaio imunossorbente ligado à enzima (ELISA) é normalmente realizado para detectar a presença e/ou quantidade de uma proteína alvo de interesse dentro de uma amostra experimental. A detecção da proteína alvo é possível por anticorpos, que fazem do ELISA um imunoensaio. Através de uma série de etapas de incubação e lavagem, esses anticorpos, que são frequentemente ligados, ou conjugados, a uma enzima, detectarão o revestimento de proteínas na parte inferior de um poço em uma placa de microtráde. Quando exposta a um substrato, a enzima ligada a anticorpos causará uma mudança de cor, indicando assim a presença da proteína de interesse na amostra.

Neste vídeo, explica-se a teoria por trás de como as ELISAs funcionam, incluindo uma discussão sobre a ligação de anticorpos primários e secundários e a importância de bloquear etapas. A teoria é seguida pela prática, à medida que o vídeo progride para uma explicação do procedimento passo a passo. Finalmente, são introduzidas variações do ELISA padrão, como o sanduíche e os ELISAs competitivos, e as aplicações do mundo real deste método, como em testes de gravidez sem prescrição médica, são explicadas.

Procedure

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O ensaio elisa, ou ensaio imunossorbente ligado à enzima, é um método amplamente utilizado para determinar a presença ou ausência de uma proteína alvo específica.

Através de uma série de etapas de lavagem e ligação, um anticorpo conjugado, ou ligado, a uma enzima reconhecerá uma proteína alvo na parte inferior de uma placa de 96 poços. Quando o substrato é adicionado à amostra, ocorrerá uma reação enzimática, causando uma mudança de cor que permite a identificação e quantificação da proteína alvo.

Antes de discutirmos como realizar um ELISA, vamos nos familiarizar com os equipamentos e reagentes que você vai precisar.

O ajuste para uma reação ELISA é tipicamente uma placa inferior plana de 96 poços. As partes inferiores planas dos poços ajudarão a facilitar uma distribuição uniforme de sua amostra experimental, bem como seus anticorpos de captura e detecção.

Os ELISAs detectam a presença de proteínas-alvo específicas em soluções aquosas experimentais. Urina, mídia de cultura celular e soro são amostras experimentais comuns.

Em um ELISA, o anticorpo que se liga diretamente à proteína alvo é o anticorpo primário. Tem alta afinidade, ou seja, uma alta capacidade de se ligar firmemente, para um epítope - uma região específica - da proteína alvo. O anticorpo primário geralmente não é rotulado, ou não conjugado.

Como mencionado, os anticorpos se ligam principalmente às suas proteínas-alvo através de alta afinidade ligando-se a um epítope específico. No entanto, a amostra experimental pode conter pedaços de células que expressam locais de ligação não específicos, locais que podem ligar a região específica ou não-epitope específica de seus anticorpos detectores.

Portanto, a adição de um buffer de bloqueio é essencial em um ELISA para cobrir quaisquer locais de ligação não específicos em suas amostras experimentais. Caso contrário, você pode ter reações enzimáticas ocorrendo em poços que não contêm proteína alvo, dando-lhe dados falsos positivos!

O anticorpo secundário em um ELISA é o anticorpo usado para reconhecer o anticorpo primário. Este anticorpo é geralmente conjugado a uma enzima. Às vezes, o anticorpo secundário tem um nome funky. Por exemplo, se o anticorpo secundário feito, ou criado, em um burro para reconhecer um anticorpo primário criado em uma cabra, o anticorpo secundário seria chamado de anticorpo anti-cabra burro. Quando se trata de nomear anticorpos secundários, o primeiro nome indica o organismo que produziu o anticorpo secundário, e o segundo nome representa o organismo que produz o anticorpo primário.

Um substrato, que se liga ao local ativo da enzima ligada ao anticorpo secundário, também será necessário. A reação química que ocorre durante esta reação causa uma mudança de cor no substrato incolor de outra forma. Este chamado ensaio colorimétrico permite a identificação e quantificação da presença da proteína alvo.

A reação enzimática continuará enquanto houver substrato disponível. Portanto, após um breve período de incubação, uma solução de parada, que faz com que outra mudança de cor indique que a reação foi de fato interrompida, é adicionada aos poços.

Um leitor de microplacão será usado para quantificar a concentração da proteína de interesse em cada poço lendo a absorvância, ou seja, a quantidade de produto colorido, em cada poço. A absorvância é proporcional à quantidade de proteína alvo presente.

Agora que você tem todo o seu equipamento pronto, vamos executar um ELISA!

Para executar um padrão, ou direto, ELISA, primeiro cubra os poços da placa de 96 poços com sua proteína alvo de interesse diluída no tampão de revestimento. Emplaque seus controles positivos e negativos neste momento também.

Depois de incubar a placa revestida tempo suficiente para dar tempo à proteína para adsorb completamente, ou anexar, na parte inferior da placa, despeje a solução de revestimento em excesso com um movimento rápido do seu pulso.

Em seguida, bloqueie qualquer possível sinal de ligação ou fundo não específico incubando cada poço no buffer de bloqueio.

Agora despeje o tampão de bloqueio e lave os poços com uma breve incubação de temperatura ambiente em salina tamponada de fosfato, ou PBS, e 1% BSA.

Enquanto os poços estão sendo enxaguados com PBS, preparem diluições de uma concentração conhecida da proteína alvo para criar uma curva padrão. A absorção dos poços de curva padrão, que contêm concentrações conhecidas da proteína alvo, será usada para calcular a concentração de proteína-alvo em seus poços experimentais baseados na comparação da absorção dos poços amostrais com a absorção dos poços de curva padrão.

Agora é hora de adicionar a detecção ou anticorpo primário!

A placa é então incubada, geralmente à temperatura ambiente, para permitir que uma quantidade suficiente de anticorpos se ligue à proteína alvo para detecção posterior e quantificação da proteína.

Após esta incubação, o excesso de anticorpos é removido e os poços são brevemente lavados com PBS.

O anticorpo secundário é então adicionado à placa, e a placa é novamente incubada – tipicamente em uma plataforma rotativa – para permitir que o anticorpo secundário se ligue. As etapas de lavagem são repetidas como antes.

Em seguida, adicione o substrato à placa para ver quais poços contêm sua proteína alvo. Cubra a placa para proteger a reação da luz e, em seguida, após uma breve incubação, pare a reação com a solução stop.

Por fim, coloque sua placa no leitor de microplacões para medir a absorção ou quantidade de solução colorida, em cada poço. Você precisará selecionar quais poços você deseja que o leitor analise. Quando o instrumento terminar de ler a placa, será exibida uma leitura da absorvência de cada poço.

É importante notar que cada kit ELISA tem um limite de detecção. Ou seja, apenas concentrações proteicas acima e abaixo de limites específicos podem ser determinadas com precisão. Concentrações muito pequenas de proteína geralmente são muito próximas dos níveis de fundo de coloração não específica, enquanto concentrações muito altas podem indicar que o excesso de proteína ou anticorpo não foi adequadamente lavado nessa amostra bem.

Então por que você pode fazer um ELISA? Vamos dar uma olhada em algumas aplicações comuns.

Provavelmente o tipo mais comum de ELISA realizado é o sanduíche ELISA.

Em um sanduíche ELISA, um prato de 96 poços é revestido primeiro com um anticorpo primário que reconhece a proteína alvo de interesse.

Neste experimento, a mídia de cultura celular colhida a partir de linhas celulares produtoras de anticorpos humanos, foram banhadas por um sistema automatizado em placas de 96 poços pré-revestidas com um anticorpo primário que reconhece anticorpos humanos.

Após lavar a amostra em excesso com PBS, um anticorpo secundário ligado à enzima é adicionado, seguido por um substrato colorimétrico.

A absorvância é então medida da mesma forma que para um ELISA típico. Por exemplo, neste experimento, esses dados ELISA serão usados para determinar quais linhas celulares produzem o anticorpo humano com maior afinidade – que é a melhor capacidade de se ligar com precisão – seu antígeno alvo.

O teste de gravidez sem prescrição é um tipo de sanduíche ELISA.

Quando a urina da mulher potencialmente grávida é adicionada ao teste, anticorpos primários ligados à enzima ligados ao teste ligarão o hormônio da gravidez hCG se ele estiver presente. Se a mulher estiver grávida, uma reação substrato-enyzme ocorrerá quando os anticorpos primários forem reconhecidos por anticorpos secundários ligados a substratos no local de teste, e uma linha colorida aparecerá.

Outro tipo de ELISA é a ELISA competitiva, que pode ser usada para detectar a presença de anticorpos.

Se os anticorpos de interesse estiverem presentes na amostra, eles se ligarão à proteína alvo anexada ao fundo da placa. Mais tarde, quando os anticorpos de detecção ligados à enzima forem adicionados à placa, os anticorpos ligados à enzima encontrarão poucas ou nenhuma proteína para se ligar; eles terão sido "superados" pelos anticorpos de interesse na amostra experimental.

Em um ELISA competitivo, então, os poços coloridos indicam as amostras que realmente não contêm o anticorpo de interesse! As amostras de plasma do paciente são tipicamente executadas em um ELISA competitivo, a fim de determinar se anticorpos para certos patógenos, como o vírus HIV, estão presentes na amostra.

Você acabou de assistir jove introdução para executar um ELISA. Neste vídeo revisamos: o que é um ELISA e como funciona; quais equipamentos e reagentes você precisará realizar e ELISA; e algumas aplicações diferentes do ensaio. Obrigado por assistir, e lembre-se de não deixar seu substrato se sobresenvolvir!

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