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Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

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Un'introduzione alla trasfezione

Overview

La trasfezione è il processo di inserimento di materiale genetico, come il DNA e l'RNA a doppio filamento, nelle cellule di mammifero. L'inserimento di DNA in una cellula consente l'espressione, o la produzione, di proteine utilizzando il macchinario delle cellule, mentre l'inserimento di RNA in una cellula viene utilizzato per down-regolare la produzione di una proteina specifica interrompendo la traduzione. Mentre il sito di azione per l'RNA trasfettato è il citoplasma, il DNA deve essere trasportato al nucleo per una trasfezione efficace. Lì, il DNA può essere espresso transitoriamente per un breve periodo di tempo, o essere incorporato nel DNA genomico, dove il cambiamento viene trasmesso da cellula a cellula mentre si divide.

Questo video descrive le basi alla base delle trasfezioni mediate da sostanze chimiche e introduce alcuni dei reagenti più comunemente usati, tra cui lipidi carichi, polimeri e fosfato di calcio. Ogni fase è descritta dalla preparazione delle cellule per la trasfezione attraverso l'analisi dell'efficienza della trasfezione. Inoltre, la sezione applicazioni di questo video-articolo descrive l'uso dell'elettroporazione e di una trasfezione biolistica come metodi alternativi per introdurre l'acido nucleico nelle cellule di mammifero. Descrive anche un uso avanzato della trasfezione in cui la co-trasfezione di RNA e DNA interferenti viene introdotta come un modo per down-regolare una proteina naturale mentre allo stesso tempo produce una variante mutante di essa all'interno della stessa cellula.

Procedure

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La trasfezione è il processo di inserimento di materiale genetico, come il DNA e l'RNA a doppio filamento, nelle cellule di mammifero. L'inserimento del DNA consente l'espressione, o la produzione, di proteine utilizzando i macchinari propri delle cellule. Mentre l'inserimento di RNA a doppio filamento viene utilizzato per arrestare la produzione di una proteina specifica interrompendo la traduzione. Questo potente strumento ha permesso ai ricercatori di studiare meglio la funzione e l'espressione genica, la funzione proteica e le mutazioni genetiche.

Nessun singolo reagente o metodo di trasfezione funziona per tutti i tipi di cellule. Fortunatamente, molti metodi e reagenti sono stati sviluppati negli ultimi decenni per facilitare la trasfezione di un'ampia varietà di cellule. Questi metodi possono essere separati in due gruppi principali: trasfezioni chimiche e fisiche.

In questo video, ci concentreremo sui diversi sistemi di consegna chimica, poiché sono diventati sempre più comuni negli ultimi anni. Questi metodi includono approcci a base lipidica, trasfezione mediata da fosfato di calcio e l'uso di polimeri cationici per citarne alcuni.

Il principio alla base di tutti i metodi di trasfezione chimica è simile. Tutti fanno uso di molecole portanti caricate positivamente che si complessano con acidi nucleici per impacchettare per la consegna cellulare. Queste molecole portanti superano la carica negativa della barriera cellula-membrana che consente loro di passare attraverso la membrana per fornire il loro contenuto.

Nella trasfezione lipidica, i lipidi cationici formano un liposoma che poi si combina con gli acidi nucleici per formare un "complesso di trasfezione". Mentre il fosfato di calcio condensa semplicemente il DNA e gli conferisce una carica positiva netta. Inoltre, i polimeri cationici come la politeleneimmina condensano il DNA in particelle caricate positivamente.

Il passo successivo nella trasfezione mediata chimica è l'attaccamento dei complessi caricati positivamente alla membrana cellulare caricata negativamente attraverso una semplice attrazione elettrostatica.

Quindi, il complesso entra nella cellula tramite endocitosi - un processo attraverso il quale le molecole entrano nella cellula attraverso vescicole legate alla membrana chiamate endosomi.

Una volta all'interno della cellula, gli acidi nucleici devono fuoriuscire dall'endosoma attraverso un processo ancora sconosciuto. Una volta al di fuori dell'endosoma, gli acidi nucleici si troveranno nel citoplasma della cellula e poi alla fine nel nucleo, dove il macchinario della cellula è in grado di produrre mRNA e quindi proteine da esso. Il citoplasma è il sito di azione per il piccolo RNA interferente, o siRNA dove riduce la produzione di proteine interferendo con una parte del meccanismo di produzione di proteine della cellula.

Il DNA trasfettato può esistere sia stabilmente che transitoriamente. Le trasfezioni stabili si verificano quando il DNA trasfettato viene introdotto nel genoma e quindi persiste mentre la cellula si divide. Le trasfezioni transitorie si verificano quando il DNA non è incorporato nel genoma e l'espressione della proteina codificata viene persa durante un arco di circa 24-96 ore.

L'efficienza della trasfezione del DNA è tipicamente misurata attraverso sistemi reporter che sono legati al gene inserito. Si tratta di sistemi che possono essere facilmente rilevati sia osservando direttamente la proteina reporter stessa, come nel caso della proteina fluorescente verde, sia misurando la sua attività enzimatica utilizzando un saggio colorimetrico, come nel caso di un reporter dell'enzima luciferasi. La trasfezione stabile del DNA è meglio misurata dall'analisi genomica come la RT-PCR.

Per misurare il successo del silenziamento del siRNA, i livelli proteici mirati in ciascun campione possono essere determinati da Immunoblot. La trasfezione di siRNA di successo dovrebbe ridurre l'espressione della proteina bersaglio all'interno delle cellule, mentre i livelli del gene di pulizia, GAPDH, rimangono stabili.

Per massimizzare l'efficienza della trasfezione, le cellule dovrebbero essere mantenute in fase di crescita logaritmo ed essere tra il 40 e l'80% confluenti, al momento della trasfezione. Per raggiungere questo obiettivo, le cellule in coltura dovrebbero essere raccolte il giorno prima ... contato... e seminato in una piastra multi-pozzo ad una concentrazione che produrrà il corretto livello di confluenza al momento della trasfezione.

Successivamente, i reagenti chimici e gli acidi nucleici vengono miscelati e viene dato il tempo di formare i complessi acido-reagente nucleico. Per ogni sistema di erogazione chimica devono essere ottimizzate le concentrazioni specifiche di ciascun componente.

I complessi acido-reagente nucleico vengono quindi aggiunti alle cellule placcate e incubati spesso durante la notte per dare un sacco di tempo ai complessi di attaccarsi alle cellule e mediare la trasfezione. Dopo 24 ore, il supporto deve essere rimosso e sostituito con un supporto di coltura fresco.

Esistono molte varianti e applicazioni della trasfezione. La co-trasfezione può consentire a un ricercatore di studiare l'effetto delle mutazioni missenso sulla funzione delle proteine cellulari. Qui, l'RNAi è stato trasfettato in cellule HeLa al fine di down-regolare la proteina endogena BRCA1, che provoca una riduzione del numero di cellule GFP positive. Allo stesso tempo, una proteina mutante BRCA1 è stata anche trasfetta e prodotta dalla cellula. Se la proteina mutata era completamente funzionante, ha causato un recupero del numero di cellule GFP positive, ma se la mutazione ha influenzato negativamente la funzione, il numero di cellule GFP positive è rimasto basso.

In alternativa ai metodi di trasfezione chimica, un ricercatore, mostrato qui, usa una pistola genetica per sparare particelle d'oro allacciate con il DNA alle cellule in coltura. Le cellule che finiscono con i piccoli proiettili rivestiti di DNA all'interno del loro citoplasma hanno buone possibilità di essere trasfettate.

Un altro metodo alternativo per la trasfezione è l'elettroporazione. L'elettroporazione è l'uso della corrente elettrica per danneggiare la membrana della cellula permettendo al DNA o all'RNA di entrare nella cellula per un breve periodo prima che le cellule abbiano il tempo di ripararsi. Qui, gli elettrodi della pinzetta sono posizionati attorno a un cervello di topo e brevi impulsi di elettricità vengono passati attraverso il cervello per avviare la trasfezione ex-vivo delle molecole di RNAi iniettate all'interno della soluzione blu. Si osservano quindi gli effetti del silenziamento genico sulla struttura della corteccia in via di sviluppo.

Hai appena visto il video di JoVE sulla trasfezione. Come sempre, grazie per aver guardato!

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