Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.

 
Click here for the English version

ג. אלגנס אחזקה

Overview

Ceanorhabditis elegans היה, והוא עדיין, רגיל להצלחה גדולה כאורגניזם מודל לחקר מגוון רחב של תופעות התפתחותיות, גנטיות, מולקולריות ואפילו פיזיות. על מנת להשתמש C. elegans למלוא הפוטנציאל שלה, טיפול נאות ותשומת לב לתחזוקה הבסיסית של אורגניזם רב עוצמה זה הוא חיוני.

בסרטון זה תלמדו את דרישות הדיור וההזנה הבסיסיות של C. elegans, כיצד לטפל ולתפעל תולעים כראוי באמצעות בחירת תולעים וכיצד להקפיא ולשחזר מלאי תולעים חשוב. לקראת סוף הסרטון נבקר בכמה יישומים של שינוי הדיור, האכלה ומניפולציה של בעלי חיים חשובים אלה.

Procedure

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

טיפול ותחזוקה נכונה של אלגנים Caenorhabditis הוא חיוני לניסויים מוצלחים.

הם דורשים מעט מאוד מקום, זולים לבית, יש פוריות גבוהה, וקל לתמרן. אבל רק בגלל שהם פשוטים להישאר בסביבה לא אומר מדע רכרוף. למעשה, סידני ברנר כינתה את C. elegans "מתנת הטבע למדע", ומאז הצגתה בשנת 1974 הוצגה התולעת במספר ניסויים זוכי פרס נובל.

בסרטון זה נדגים שיטות בסיסיות לשמירה על C. elegans במעבדה, כולל: דיור והאכלה, טיפול, כמו גם הקפאה והפשרה של תולעים.

בטבע, C. elegans נמצאים באדמה וניזונים מחומר צמחי נרקב. במעבדה, חשוב לשמור על נמטודות מאושרות ככל האפשר, ולכן אנו מאכלסים ומאכילים אותם בשיטות ספציפיות מאוד.

C. elegans ניתן לגדל ב 16, 20, או 25 °C בהתאם לדרישות הניסוי, והוא יכול להיות גדל על מוצק או במדיה נוזלית. בשני המקרים הם מוזנים OP50, זן מתוקנן של E. coli המשמש במיוחד לתרבות נמטודה בכל מעבדת תולעים ברחבי העולם.

כאשר גדל ב 25 °C. elegans להשלים את מחזור החיים שלהם 2.1 פעמים מהר יותר מאשר כאשר גדל ב 16 °C (50 °F). מחזור חיים מהיר יותר פירושו שהתולעים מבשילות מהר יותר, מטילות יותר ביצים וצורכות יותר מזון. אם תולעים מורשות לגווע ברעב או להיות צפופות מדי, הן נכנסות לשלב זחל שנקרא בימת דאואר. זחלי דאואר עמידים בפני מתח ואינם מזדקנים.

כאשר נשמרים על מדיה מוצקה, C. elegans גדלים על לוחות אגר מוכנים עם מדיה צמיחה נמטודה או מדיה NGM. יום לפני ביצוע צלחות, לחסן מדיה LB נוזלי עם מושבה אחת של OP50 E. coli. לדגור על התקשורת ב 37 °C (50 °F) לילה עם רועד.

כדי להפוך מדיה מוצקה, למדוד ולשלב את הכמויות המתאימות של מרכיבים אלה עם מים deionized בבקבוק Erlenmeyer.

לאחר autoclaving לפחות 15 דקות, לתת אגר להתקרר ל 55 °C (55 °F) באמבט מים. לאחר התקשורת התקררה ל 55 °C (55 °F) אתה אמור להיות מסוגל להחזיק בנוחות את מיכל הזכוכית בידיים חשופות. באמצעות טכניקה אספטית נכונה, תוספים כמו תרופות או אנטיביוטיקה ניתן להוסיף בשלב זה. מערבבים לערבב. לאחר מכן, פיפטה מותכת NGM לתוך לוחות פטרי עד שהם 2/3 מלא. תן לצלחות החדשות להתייבש על הספסל למשך הלילה.

למחרת בבוקר גלולה OP50 ב 3500 x g במשך 10 דקות ולאחר מכן resuspend החיידקים במדיה LB לריכוז 10X. עכשיו, צנרת דשא מרכזי על כל צלחת. הימנעו מלגעת בקצה הצינור אל פני השטח של ה- NGM והדאגו לא לאפשר לתרבות לגעת בקירות הצלחת. להשאיר צלחות להתייבש על הספסל לילה. לאחר יבש, לחשוף צלחות לאור UV כדי לעקר אותם. כעת הם מוכנים לשימוש כאשר תולעי פולחן.

C. elegans הם מניפולציה בנפרד באמצעות כלי המכונה בחירת תולעת. הבחירה עשויה בדרך כלל מ 30 מד 90% פלטינה ו 10% חוט אירידיום, אם כי כמה חוקרים עשויים להעדיף הרכבי מתכת שונים במקצת. כדי לבחור, התחל על ידי שבירת הקצה של צנרת פסטר לאורך המועדף.

חותכים כ -3 עד 4 ס"מ של חוט ומניחים 0.5 ס"מ ממנו בתוך קצה הצינור. לאטום את החוט לזכוכית מעל מבער בונזן. אורך החוט הבולט מהכוס הוא כ -3 עד 3.5 ס"מ אך יכול להשתנות בהתאם להעדפות הפרט.

לשטח את קצה החוט באמצעות קצה קשיח. לאחר מכן לכופף את החלק השטוח כלפי מעלה כדי ליצור כף מדידה. לבסוף, חול הקצוות של הבחירה כדי למנוע פגיעה בתולעת או אגר.

לקטוף תולעים לחטא את חוט הפיק על להבה. לאחר מכן מצפים את הקצה ב-OP50 E. coli עבה ודביק מצלחת NGM. השתמש בזהירות כדי לא לנקב או צלקת משטח אגר.

תוך כדי התבוננות דרך טווח ניתוח, יש לגרוף קלות את התולעת על הקטוח השטוח והדביק עד שהתולעת נדבקת לבחירה.

ברגע שהתולעת היא על הבחירה, מיד להעביר על ידי החזקה קלה את הקצה אל פני השטח החדשים של צלחת חדשה והחליק אותו על פני הדשא החיידקי. התולעת צריכה לזחול מהפיק. התולעת לא צריכה להישאר על הבחירה במשך זמן רב מדי או שזה עלול להתייבש.

אחת הסיבות מדוע C. elegans הוא מודל פופולרי למחקר היא כי תרבויות ניתן לאחסן במשך פרקי זמן ארוכים ללא כל השפעה שלילית.

ראשית, לשטוף זחלים מורעבים טריים באמצעות 0.5 מ"ל M9 Buffer, מערבבים בעדינות כדי לשחרר את כל הזחלים ובעלי החיים הבוגרים, ולאחר מכן להעביר microcentrifuge או cryotube. לאחר מכן, הוסף כמות שווה 30% גליסול במאגר M9. לבסוף, לארוז את המשחקון לתוך קופסה מבודדת ולאחסן ב -80 °C (80 °F).

כדי לשחזר תולעים, להסיר את הצינור ממקפיא -80 ולתת להפשיר בטמפרטורת החדר עד התוכן נמס לחלוטין. מעבירים את הנוזל על צלחת NGM טרייה עם מדשאת OP50 ודגרה ב 20 °C (70 °F). לאחר 2-3 ימים, להעביר 10-15 בעלי חיים לצלחת חדשה ולאפשר להם להתרבות במשך דור אחד. לאסוף את צאצאים וציון עבור פנוטיפים נכונים.

כעת, לאחר שראינו כיצד C. elegans נשמר במעבדה, בואו נסתכל על האופן שבו תנאי האכלה, דיור וטיפול משתנים לניסויים.

תגלית הנובל הזוכה של הפרעות RNA אפשרה לחוקרים להשתיק כל גן C. elegans כדי לקבוע את תפקידו.

אנחנו יכולים לגרום RNAi ב C. elegans על ידי הכנת צלחות הראשונות עם E. coli המבטאים dsRNA גן היעד, אשר התולעים יאכלו.

ואז תולעי שלב הזחל הרביעי מועברות לצלחות RNAi ומותר להטיל ביצים. בשלב הרצוי של הפיתוח הצאצאים נאספים ומבקיעים עבור פנוטיפים. מכיוון שאנו חולקים כמחצית מהגנום שלנו עם התולעת, רבות מהתובנות שלקטנו חלות על מחלות אנושיות.

בגלל מחזור החיים המהיר שלה, C. elegans מתאים במיוחד כמודל של הזדקנות.

ראשית, נוצרת אוכלוסייה מסונכרנת בזמן של C. elegans, על ידי מתן אפשרות הרמפרודיטים למבוגרים להטיל ביצים על לוחות גז טבעי נוזלי. התולעים מטילות ביצים במשך 6-8 שעות ולאחר מכן מוסרות.

כאשר תולעים נמצאות בשלב הרצוי הן מועברות ללוחות NGM חדשים המכילים אמפצילין כדי למנוע זיהום חיידקי ו- FUDR כדי למנוע רבייה.

מנקודה זו ואילך תולעים בוגרות נצפות כל 2-3 ימים עד שכל התולעים מתו. תולעים מתות מוסרות מהצלחת ומספר התולעים החיות והמתות מתועד.

ניתוח תוחלת החיים בהקשר של עלבונות גנטיים או סביבתיים יכול להניב תובנות משמעותיות על תהליך ההזדקנות.

באמצעות לייזרים ניתן לבצע אקסוטומיה או חיתוך של אקסונים בודדים, ב C. elegans חי כדי ללמוד כיצד תאי עצב להתחדש.

אבל, בגלל תולעים אף פעם לא לשמור עדיין, הם ממוקמים על 10% רפידות אגרוז בתמיסה של חיידקים. פתק כיסוי ממוקם למעלה. המיקרואורגניזמים מגבירים את מקדם החיכוך של אינטראקציית הכריות-מכסה, ולמעשה מקפיאים את התולעת במקום.

השקופית מוכנה כעת לביצוע אקסוטומיה. הנוירונים מוצגים ומתמקדים במיקרוסקופ. לאחר מכן נורה הלייזר באמצעות דוושת הרגל. כוח לייזר אופטימלי ינתק את הנוירון מבלי לפגוע במבנים סמוכים. כמה שיותר אקסונים נחתכים לכל חיה.

כרית אגרוז מוסרת בזהירות מהשקופית, ותולעים מורשות להתאושש על צלחת NGM זרעים ב 20 °C (70 °F). בין 8-48 שעות לאחר האקסוטומיה, הנוירונים יכולים להיות מוכנים להבקיע להתחדשות. בחלק הדיסטלי של החתך, הנוירון יוצר גדם. עם זאת, בחלק הפרוקסימלי הנוירון מחדש ויוצר נוריטים מוארכים.

הרגע צפית בתחזוקה בסיסית של ג'וב על תחזוקת צ'נורהאבדיטיס אלגנס בסיסית. בסרטון זה סקרנו: דיור והאכלה של C. elegans, טיפול בהם, והקפאה והתאוששות של נמטודות.

עשינו גם סיור קצר דרך כמה יישומים שהופכים C. elegans כלי מחקר כל כך חזק. למרות ש- C. elegans שונה ליונקים בדרכים רבות, המבנה הגנטי הדומה שלהם, קלות התחזוקה והמניפולציה הפשוטה שלהם הופכים אותם למודל חשוב בחיפוש אחר ביולוגיה ומחלות של יונקים. תודה שצפיתם!

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter