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Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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C. elegans Manutenzione

Overview

Ceanorhabditis elegans è stato, ed è tuttora, utilizzato con grande successo come organismo modello per lo studio di una varietà di fenomeni di sviluppo, genetici, molecolari e persino fisici. Al fine di utilizzare C. elegans al suo pieno potenziale, è essenziale una cura adeguata e un'attenzione al mantenimento di base di questo potente organismo.

In questo video imparerai i requisiti di base di alloggiamento e alimentazione di C. elegans, come gestire e manipolare correttamente i vermi usando un worm pick e come congelare e recuperare importanti stock di vermi. Verso la fine del video visiteremo alcune applicazioni di modifica dell'alloggiamento, dell'alimentazione e della manipolazione di questi importanti animali.

Procedure

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La corretta cura e il mantenimento della Caenorhabditis elegans sono essenziali per esperimenti di successo.

Richiedono pochissimo spazio, sono economici da ospitare, hanno un'alta fecondità e sono facili da manipolare. Ma solo perché sono semplici da tenere in giro non significa scienza stravagante. In effetti, Sydney Brenner ha notoriamente chiamato C. elegans "Il dono della natura alla scienza", e sin dalla sua introduzione nel 1974 il verme è stato descritto in una serie di esperimenti vincitori del premio Nobel.

In questo video dimostreremo i metodi di base per il mantenimento di C. elegans in laboratorio, tra cui: alloggiamento e alimentazione, manipolazione, nonché congelamento e scongelamento dei vermi.

In natura, C. elegans si trova nel terreno e si nutre di materia vegetale in decomposizione. In laboratorio, è importante mantenere i nematodi il più felici possibile, e quindi li ospitiamo e li nutriamo usando metodi molto specifici.

C. elegans può essere coltivato a 16, 20 o 25 °C a seconda delle esigenze dell'esperimento e può essere coltivato su mezzi solidi o liquidi. In entrambi i casi vengono alimentati con OP50, un ceppo standardizzato di E. coli utilizzato specificamente per la coltura di nematodi in ogni laboratorio di vermi in tutto il mondo.

Se coltivati a 25 °C, i C. elegans completano il loro ciclo di vita 2,1 volte più velocemente rispetto a quando vengono coltivati a 16 °C. Un ciclo di vita più veloce significa che i vermi maturano più velocemente, depongono più uova e consumano più cibo. Se ai vermi viene permesso di morire di fame o diventare troppo affollati, entrano in uno stadio larvale chiamato stadio dauer. Le larve di Dauer sono resistenti allo stress e non invecchiano.

Se mantenuti su mezzi solidi, I C. elegans vengono coltivati su piastre di agar preparate con mezzi di crescita di nematodi o mezzi NGM. Il giorno prima di fare le piastre, inoculare i mezzi LB liquidi con una singola colonia di OP50 E. coli. Incubare il mezzo a 37 °C durante la notte con agitazione.

Per produrre mezzi solidi, misurare e combinare le quantità appropriate di questi ingredienti con acqua deionizzata in un matraccio Erlenmeyer.

Dopo l'autoclave per almeno 15 minuti, lasciare raffreddare l'agar a 55 °C a bagnomaria. Una volta che il supporto si è raffreddato a 55 °C si dovrebbe essere in grado di tenere comodamente il contenitore di vetro a mani nude. Utilizzando una corretta tecnica asettica, additivi come farmaci o antibiotici possono essere aggiunti in questo momento. Vortice da mescolare. Quindi, pipettare NGM fuso in piastre di Petri fino a quando non sono 2/3 pieni. Lasciare asciugare i piatti appena fatti sulla panca durante la notte.

La mattina successiva pellet l'OP50 a 3500 x g per 10 minuti e poi riconsedia i batteri in mezzo LB a una concentrazione di 10X. Ora, pipettare un prato centrale su ogni piatto. Evitare di toccare la punta del pipetto sulla superficie dell'NGM e fare attenzione a non permettere alla coltura di toccare le pareti della piastra. Lasciare asciugare i piatti sul banco durante la notte. Una volta asciutte, esporre le piastre alla luce UV per sterilizzarle. Ora sono pronti per essere utilizzati durante la coltivazione di vermi.

C. elegans viene manipolato individualmente utilizzando uno strumento noto come worm pick. Il plettro è in genere realizzato con filo di platino calibro 30% 90% e filo di iridio al 10%, anche se alcuni ricercatori potrebbero preferire composizioni metalliche leggermente diverse. Per fare una scelta, inizia rompendo la punta di una pipetta Pasteur alla lunghezza preferita.

Tagliare circa 3-4 cm di filo e posizionarne 0,5 cm all'interno della punta del pipetto. Sigillare il filo al vetro sopra un bruciatore Bunsen. La lunghezza del filo che sporge dal vetro è di circa 3-3,5 cm ma può variare in base alle preferenze individuali.

Appiattire l'estremità del filo utilizzando un bordo duro. Quindi piegare la porzione appiattita verso l'alto per formare uno scoop. Infine, carteggiare i bordi del plettro per evitare di danneggiare il verme o l'agar.

Per raccogliere i vermi sterilizzare il filo del plettro su una fiamma. Quindi rivestire la punta con OP50 E. coli spessa e appiccicosa da una piastra NGM. Prestare attenzione a non forare o cicatrizzare la superficie dell'agar.

Mentre guardi attraverso un cannocchiale di dissezione, raccogli leggermente il verme sul plettro appiattito e appiccicoso fino a quando il verme non si attacca al plettro.

Una volta che il verme è sul plettro, trasferire immediatamente tenendo leggermente la punta sulla nuova superficie di una nuova piastra e facendola scorrere sul prato batterico. Il verme dovrebbe strisciare fuori dal plettro. Il verme non dovrebbe rimanere sul plettro troppo a lungo o potrebbe asciugarsi.

Uno dei motivi per cui C. elegans è un modello popolare per la ricerca è perché le colture possono essere conservate per lunghi periodi di tempo senza alcun effetto negativo.

In primo luogo, lavare le larve appena affamate usando 0,5 ml di M9 Buffer, ruotare delicatamente per allentare tutte le larve e gli animali adulti, quindi trasferirli in un microcentrifuga o criotubo. Quindi, aggiungere la stessa quantità di glicerolo al 30% in M9 Buffer. Infine, imballare il flaconcino in una scatola isolata e conservare a -80 °C.

Per recuperare i vermi, rimuovere il tubo da un congelatore -80 e lasciare scongelare a temperatura ambiente fino a quando il contenuto non si scioglie completamente. Pipettare il liquido su una piastra NGM fresca con prato OP50 e incubare a 20 °C. Dopo 2-3 giorni, trasferire 10-15 animali in un nuovo piatto e consentire loro di riprodursi per una generazione. Raccogli la progenie e il punteggio per i fenotipi corretti.

Ora che abbiamo visto come C. elegans viene mantenuto in laboratorio, diamo un'occhiata a come le condizioni di alimentazione, alloggiamento e manipolazione vengono modificate per gli esperimenti.

La scoperta vincitrice del Nobel dell'interferenza dell'RNA ha permesso ai ricercatori di silenziare qualsiasi gene C. elegans per determinarne la funzione.

Possiamo indurre RNAi in C. elegans preparando prima piastre con E. coli che esprimono il gene bersaglio dsRNA, che i vermi mangeranno.

Quindi i vermi del 4 ° stadio larvale vengono trasferiti alle piastre RNAi e autorizzati a depostare le uova. Nella fase desiderata di sviluppo la progenie viene raccolta e valutata per fenotipi. Poiché condividiamo circa la metà del nostro genoma con il verme, molte delle intuizioni raccolte sono applicabili alle malattie umane.

A causa del suo rapido ciclo di vita, C. elegans è particolarmente adatto come modello di invecchiamento.

In primo luogo, viene generata una popolazione sincronizzata nel tempo di C. elegans, consentendo agli ermafroditi adulti di deportare le uova su piastre NGM. I vermi depongono le uova per 6-8 ore e poi vengono rimossi.

Quando i vermi sono nella fase desiderata, vengono trasferiti in nuove piastre NGM contenenti ampicillina per prevenire la contaminazione batterica e FUDR per impedire la riproduzione.

Da questo punto in avanti i vermi adulti vengono osservati ogni 2-3 giorni fino a quando tutti i vermi sono morti. I vermi morti vengono rimossi dalla piastra e viene registrato il numero di vermi vivi e morti.

Analizzare la durata della vita nel contesto di insulti genetici o ambientali può fornire informazioni significative sul processo di invecchiamento.

Utilizzando i laser è possibile eseguire assotomie o il taglio di singoli assoni, in C. elegans vivo per studiare come si rigenerano le cellule nervose.

Ma, poiché i vermi non si fermano mai, vengono posti su cuscinetti di agarose al 10% in soluzione di microsfere. Una scivolata di copertura è posizionata sopra. Le microsfere aumentano il coefficiente di attrito dell'interazione pad-coverslip, congelando efficacemente il verme in posizione.

La diapositiva è ora preparata per l'esecuzione di astomie. I neuroni vengono portati in vista e centrati sul microscopio. Il laser viene quindi sparato utilizzando il pedale. La potenza laser ottimale speterrà il neurone senza danneggiare le strutture adiacenti. Il maggior numero possibile di assoni viene tagliato per animale.

Il tampone di agarose viene quindi accuratamente rimosso dal vetrino e i vermi possono recuperare su una piastra NGM seminata a 20 °C. Tra 8-48 ore dopo l'astomia, i neuroni possono essere preparati a segnare per la rigenerazione. Nella parte distale del taglio, il neurone forma un moncone. Tuttavia, nella porzione prossimale il neurone si rigenera formando neuriti allungati.

Hai appena visto l'opinione di JoVE sulla manutenzione di base di Ceanorhabditis elegans. In questo video abbiamo esaminato: alloggio e alimentazione di C. elegans, manipolazione e congelamento e recupero dei nematodi.

Abbiamo anche fatto un breve tour attraverso alcune applicazioni che rendono C. elegans uno strumento di ricerca così potente. Sebbene C. elegans sia dissimile dai mammiferi in molti modi, il loro corredo genetico simile, la facilità di manutenzione e la semplice manipolazione li rendono un modello importante nella ricerca della comprensione della biologia e delle malattie dei mammiferi. Grazie per l'attenzione!

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