Overview
La trasfezione - il processo di trasferimento di materiale genetico nelle cellule - è un potente strumento per la manipolazione rapida ed efficiente dell'espressione genica nelle cellule. Poiché questo metodo può essere utilizzato per silenziare l'espressione di proteine specifiche o per guidare l'espressione di proteine estranee o modificate, la trasfezione è uno strumento estremamente utile nello studio dei processi cellulari e molecolari che governano la funzione neuronale. Tuttavia, i neuroni maturi hanno una serie di proprietà che li rendono difficili da trasfezionare, quindi sono necessarie tecniche specializzate per la manipolazione genetica di questo tipo di cellula.
Questo video esamina i principi e la logica alla base dei neuroni trasfetturanti. Vengono discusse tre strategie comuni per la trasfezione neuronale, tra cui nucleofezione, gene-gun e trasduzione virale. Oltre a descrivere come ciascuna di queste tecniche supera le sfide associate alla trasfezione dei neuroni, la presentazione include una descrizione di come vengono eseguiti tutti e tre i metodi. Infine, vengono introdotte diverse applicazioni della trasfezione neuronale, come l'espressione di proteine fluorescenti di tubulina per visualizzare la morfologia dei neuroni e il silenziamento genico selettivo per generare un modello di coltura cellulare del morbo di Parkinson.
Procedure
La trasfezione - il trasferimento di materiale genetico nelle cellule di mammifero - è uno strumento prezioso che consente agli scienziati di manipolare geneticamente i neuroni e il tessuto neuronale. Le proprietà uniche delle cellule delicate rendono la trasfezione impegnativa e richiedono tecniche specializzate.
Questo video esaminerà i principi alla base della trasfezione dei neuroni e introdurrà strategie comunemente utilizzate su queste cellule, tra cui nucleofezione, trasfezione biolistica e trasduzione virale. Infine, discuteremo le applicazioni delle tecniche di trasfezione nella ricerca sulle neuroscienze cellulari e molecolari.
Iniziamo rivedendo come funziona la trasfezione. Mentre il materiale genetico può essere consegnato in prossimità di una cellula coltivata aggiungendolo al mezzo circostante, i nucleotidi non possono penetrare in modo efficiente nelle membrane cellulari.
Tutti i protocolli di trasfezione sono progettati per consentire al materiale genetico di aggirare questa barriera. I nucleotidi che bloccano la produzione di proteine, come il silenziamento dell'RNA, possono immediatamente svolgere la loro funzione una volta entrati nel citoplasma. Tuttavia, i costrutti basati sul DNA devono essere trasportati nel nucleo per la traduzione prima che la sintesi proteica possa iniziare.
Nella divisione delle cellule, la rottura dell'involucro nucleare durante la mitosi può comportare l'incorporazione del DNA trasfettato nei nuclei delle cellule figlie riformanti. Poiché la maggior parte dei neuroni in coltura sono cellule post-mitotiche o non in divisione, sono necessari protocolli di trasfezione specializzati per indurre con successo l'espressione genica.
Iniziamo la nostra panoramica di questi protocolli con nucleofezione. Questa tecnica utilizza una combinazione di un campo elettrico indotto e reagenti chimici, che agiscono insieme per creare strutture transitorie simili a pori sia nelle membrane cellulari che in quella nucleare. Poiché i nucleotidi sono carichi, il campo elettrico guida anche il movimento del DNA attraverso i pori.
Per eseguire questa procedura, i neuroni in sospensione vengono raccolti in un pellet mediante centrifugazione prima della risuspensione nel reagente nucleofezione commerciale. La miscela cellulare viene quindi combinata con dna purificato e trasferita in una cuvetta di elettroporazione, che presenta due piastre di alluminio che entrano in contatto elettrico con l'apparato nucleofettatore. Questo dispositivo eroga una serie di impulsi elettrici rapidi, il cui numero e durata sono personalizzati in base al tipo di cella. Dopo la nucleofezione, le cellule possono essere diluite in terreno di coltura e placcate per una crescita continua.
In alternativa, la tecnica della pistola genetica esplode attraverso le barriere di trasfezione, sparando proiettili che trasportano materiale genetico attraverso le membrane cellulari e nucleari.
Per produrre proiettili di pistola genetica, il DNA che codifica il tuo gene di interesse viene precipitato su perle su scala micron, di solito composte da oro. Dopo un'incubazione di 10 minuti, le perle vengono lavate e trasferite in tubi. Il tubo viene quindi ruotato mentre la soluzione si asciuga, risultando in un rivestimento uniforme di perle. Successivamente, il tubo viene tagliato in cartucce e caricato nella pistola. La consegna a gas del carico genetico può essere eseguita su cellule che crescono in piastre di coltura standard con una semplice pressione del grilletto.
Infine, la trasduzione virale sfrutta il ciclo di vita virale per fornire materiale genetico estraneo nel nucleo. L'RNA che codifica per il gene di interesse è confezionato in retrovirus modificati noti come vettori lentivirali, che ottengono l'ingresso nelle cellule bersaglio legandosi a specifiche proteine di membrana, innescando un evento di fusione della membrana. L'RNA virale viene quindi trascritto inversamente in un filamento di DNA complementare che viene trasportato nel nucleo.
Prima di iniziare questa procedura, si noti che i virus possono infettare le cellule del corpo e quelle del piatto, quindi seguire le linee guida sulla sicurezza è estremamente importante.
Il primo passo è generare le particelle lentivirali che trasportano il tuo gene di interesse. Ciò si ottiene esprimendo gli elementi costitutivi del virus in una linea cellulare umana ottimizzata per la produzione virale, come le cellule 293T. Per evitare l'inutile diffusione di virus ingegnerizzati, i geni necessari per il loro assemblaggio sono tenuti separati dal vettore di trasferimento, la cui sequenza sarà inclusa nella particella infettiva.
Ci vogliono circa 2 giorni perché i virus completamente assemblati vengano rilasciati nel terreno di coltura, dove possono essere raccolti e concentrati mediante ultracentrifugazione. Successivamente, la concentrazione appropriata, o titolo, del virus viene determinata valutando il successo della trasduzione in una linea cellulare di prova. Il vettore lentivirale viene quindi aggiunto alla coltura neuronale bersaglio e in genere incubato per 24-48 ore per garantire che si sia verificata l'infezione.
Ora che hai familiarità con le tecniche di trasfezione comuni, quella che usi dipenderà dagli obiettivi specifici dei tuoi esperimenti. Diamo un'occhiata ad alcuni esempi.
Per iniziare, l'osservazione della maturazione dei neuroni in coltura consente un'analisi dettagliata dei cambiamenti morfologici che sono importanti per la connettività neuronale, come la formazione di spine dendritiche. Per visualizzare la morfologia cellulare nel tempo, questi ricercatori hanno fatto uso della nucleofezione per fornire una proteina fluorescente nei neuroni in coltura. Qui, una proteina tubulinica marcata con fluorescenza è stata trasfetta in un sottoinsieme di cellule, consentendo analisi dettagliate dei processi cellulari tramite microscopia a fluorescenza. Poiché i livelli di espressione sono stati mantenuti per tutta la vita del neurone, l'analisi morfologica potrebbe essere eseguita per almeno un mese in coltura.
La trasfezione può anche essere utilizzata per testare l'impatto di specifiche mutazioni genetiche sulla funzione neuronale. Una pistola genetica può essere utilizzata per fornire DNA che codifica per versioni wild type o mutanti di una proteina e gli impatti a breve termine sulla biologia cellulare possono essere valutati, ad esempio mediante la registrazione del patch clamp del fuoco dei neuroni.
Infine, una strategia comune per testare la funzione di un gene è osservare cosa succede alle cellule quando la sua espressione è bloccata. Per questi esperimenti, i vettori lentivirali possono essere utilizzati per fornire costrutti di RNA silenziante, che impediscono la sintesi proteica. In questo esperimento, l'abbattimento dei geni associati al morbo di Parkinson porta ad una significativa diminuzione della vitalità cellulare.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla trasfezione dei neuroni. In questo video abbiamo introdotto i principi della trasfezione neuronale, nonché le procedure e le applicazioni per tre strategie di trasfezione comuni.
Grazie per l'attenzione!
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarato.
