Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En Guide till produktion, kristallisering och strukturbestämning av mänskliga IKK1/α
Chapters
Summary November 2nd, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
IκB Kinase 1/α (IKK1/α CHUK) är en Ser/Thr proteinkinas som är inblandad i en myriad av cellulära aktiviteter främst genom aktivering av NF-κB transkriptionsfaktorer. Här beskriver vi de viktigaste stegen som krävs för produktion och crystal strukturbestämning av detta protein.
Transcript
Målet med detta förfarande är att ge vägledning för produktion, kristallisering och strukturell bestämning av mänskliga IKK1-alfa för att förstå den mekanistiska grunden för dess signaleringsfunktion och att upprätta plattformar för rationell läkemedelsdesign. Denna metod bör hjälpa forskare att fastställa strukturen för IKK1, vilket skulle ge svar på viktiga frågor inom området immunsignalering. Denna teknik beskriver en strömlinjeformad väg till att erhålla kristaller av IKK-proteiner, som är ganska eldfasta till kristallisering och att ge olika kritisk information för att övervinna flaskhalsar vid fastställandet av strukturerna.
Generellt, individer nya till denna metod kommer att kämpa, eftersom generera milligram mängder lösliga, väluppfostrat protein, kräver sitt uttryck i insektsceller, och kristallisering kan göras under endast ett mycket smalt fönster av villkor. Det molekylära ersättningsförfarandet som används vid bestämningen av strukturen för IKK1 kan också vara mycket knepigt, särskilt på grund av dålig avböjningsegenskap hos kristallerna, inte på platsen för den asymmetriska enheten som innehåller många IKK1-molekyler i avsaknad av lämpliga sökmodeller. Demonstrera förfarandena kommer att Kyle Shumate och Sonjiala Hotchkiss, studenter från mitt laboratorium.
På dag ett, tallrik Sf9 celler i två milliliter av Sf903 insektscell medium, i varje brunn av en sex-brunn tallrik och inkubera vid 27 grader Celsius. Passage cellerna när de når en densitet av två till tre gånger 10 till de sex cellerna per milliliter i suspension genom att späda ut den till färska medier, med en densitet av cirka sex gånger 10 till fem. På dag två, späd åtta mikroliter av Sf9 transfection reagens i 100 mikroliter av SF-903 eller Grace's Insect Medium.
Då virvel blandningen kort. I ett separat rör, späd ett mikrogram kit-renad rekombinant bacmid i 100 mikroliter av samma medium. Kombinera det utspädda DNA- och transfektionsreagensen.
Efter inkubering i rumstemperatur i 15 till 30 minuter, ta bort mediet från brunnen. Tillsätt sedan en milliliter färskt medium. Därefter tillsätt den utspädda DNA-transfektionsreagensblandningen droppvis på cellerna, justera droppstorleken så att den inte rubbar vidhäftande celler.
Efter sex timmar, tillsätt 1,5 milliliter färskt medium ovanpå cellerna. Inkubera cellerna vid 27 grader Celsius, kontrollera brunnarna regelbundet var 12 timmar för tecken på virusinfektion. På dag fem, ta bort mediet som innehåller celler, 60 till 72 timmar efter infektion.
Efter överföring av mediet i rör, centrifug i fem minuter vid 500 gånger g och fyra grader Celsius. När du är klar, spara supernatanten, som är P1-virusstacken. På dag ett, resuspend den tidigare beredda His-IKK1 cell pellet i 40 milliliter av lysbuffert.
Placera cellen suspension på is och lysa cellerna genom ultraljudsbehandling på 60%till 70%tull cykler och fem till 10 pulser på 30-sekunders varaktighet med ett intervall större än en minut. Klargöra lysate genom centrifugeringen vid större än eller lika med 28, 000 g i 45 minuter vid fyra grader Celsius. Efter att ha förberett en Nickel-NTA Agarose harts, enligt textprotokollet, elute den Hans-taggade IKK1 alfa protein under gravitationen flöde med 20 milliliter eluering buffert.
Samla en till 1,5 milliliter fraktioner. Efter att ha kombinerat de fraktioner som innehåller proteinet, smälta provet med TEV proteas över natten vid fyra grader Celsius. På morgonen dag två, inkubera proteinet med en millimolar av ATP, i närvaro av magnesiumklorid, beta-glycerofosfat, natriumfluorid och natrium ortovanadate i en timme vid 27 grader Celsius.
Efter inkubation, filtrera proteinlösningen genom ett 0,45 mikronfilter. Sedan lasta cirka sex milliliter av provet på en 120 milliliter preparativ storlek-uteslutning kolumn, fäst vid en automatiserad vätskekromatografi system. Efter jämvikt, kör storleken-exclusion kromatografi med en flödeshastighet på en milliliter per minut och samla två-milliliter fraktioner.
Under körningen, övervaka eluering vid 280 och 254 nanometer. Efter att ha dragit de rena fraktionerna, koncentrera dig i en 30-kilodalton, molekylvikt cut-off centrifugalkoncentrator, efter tillverkarens instruktioner. Sedan dispensera 25-mikroliter alikvoter av det koncentrerade proteinet och flash-freeze i flytande kväve.
Med hjälp av en robot, pipetter 80 till 100 mikroliter av en kristallisering reagens i reservoaren av en 96-brunns platta. Med hjälp av en kristalliseringsrobot, dispensera och blanda 0,2 till 0,25 mikroliter av IKK1 och dess hämmarkomplex med samma volym reservoarlösning. Omedelbart efter inställning av dropparna, försegla varje platta med optiskt tydliga filmer för att undvika avdunstning.
Inkubera en platta vid 18 grader Celsius och den andra plattan vid fyra grader Celsius i ett kallt rum. Använd ett stereomikroskop med en polarisator för att kontrollera om det finns kristall i varje droppe, varje dag, under de första sju dagarna och sedan med längre intervall. Efter att ha förberett IKK1 och dess inhibitorkomplex som tidigare beskrivits, överför du brunnslösningarna till varje brunn av en 24-brunnsplatta.
Placera en till 1,5 mikroliter av väl lösning på en ren glasöverdrag. Tillsätt en lika stor volym av IKK1 och dess hämmarkomplex till glasöverdrag och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner tre till fyra gånger. Efter applicering av fett på ringarna i varje brunn av plattan, vänd glaset täck över och placera på respektive brunn med tutens.
Sedan försegla brunnen genom att trycka ner på glaset täck. Efter att ha satt upp alla droppar i 24-brunnsplattan, inkubera i kylrummet, i mörkret. Ibland kontrollera dropparna under ett mikroskop för utseende och tillväxt av kristaller.
När kristalltillväxten är klar tar du försiktigt bort glaskåpan som innehåller kristallen och placerar den på en fast yta med kristalldropin uppåt. Tillsätt försiktigt 10 mikroliter kryo A-lösning ovanpå droppen och blanda försiktigt genom pipettering så att kristallen inte vidrörs. Med hjälp av ett mikroskop, långsamt ta bort lite vätska från kristallen och hålla cirka fem till åtta mikroliter av lösningen.
Tillsätt försiktigt 2,5 till fyra mikroliter kryo B-lösning på droppen och blanda försiktigt genom pipettering. Täck glaset coverslip med en liten Petrie skålen för att undvika direkt luftflöde över kristallen. Efter att ha väntat fem minuter, välj försiktigt en enda kristall från droppen i en lämplig kryoby monterad på en ordentlig bas.
Flash-frysa kristallen i flytande kväve. Förvara sedan kristallen som innehåller kryoby i en puck nedsänkt i flytande kväve i en Dewar-kolv tills den är redo för röntgendiffraktion vid synkrotronen. Efter omfattande försök med flera olika IKK1-varianter erhölls kristaller med en stympad konstruktör, som visade lämpliga röntgenegenskaper endast i närvaro av IKK-hämmaren XII.
Den kombinerade effekten av röntgendata med lågupplösning med svag intensitet, ett stort antal IKK1-molekyler i den asymmetriska enheten och konformationsvariationen av IKK1 monomerisk-dimerisk modell, jämfört med kända IKK2-modeller, gjorde det svårt att få tag på en molekylär ersättningslösning, IKK1, och bestämma dess struktur. Olika IKK2-strukturer indikerade olika intermonomerorientering inom dess dimers så att avståndet mellan alfakolerna i P578 i de två kinasdomänerna, i fyra olika dimermodeller, varierade mellan 39 och 61 ångström. Att få en användbar sökmodell var möjligt på grund av den lågupplösta kryoelektronmikroskopikartan och en högnoggrann modell av IKK1-domäner som kunde genereras baserat på en högupplöst IKK2-struktur.
Den ursprungliga modellen anges en orientering av Kinas domän roteras 24 grader i förhållande till en IKK2 monomer och en N-terminal öppning av 58 ångström. Med hjälp av en av dimers med 52-ångströmsöppningen som modell, var sex dimers i den asymmetriska enheten belägna. När behärskar, kan denna teknik utföras i ett par månader, om det utförs på rätt sätt.
Medan du försöker detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att erhållandet av en löslig, aktiv och väluppfostrad protein är det första kritiska steget. Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god allmän förståelse för alla de steg som måste följas i noggranna detaljer, för att vara framgångsrik i kristallisera och bestämma strukturen av IKK1 protein. Att lära sig detta förfarande, det finns fortfarande strukturer av andra IKK familj proteiner som också kan fastställas för att svara på ytterligare frågor om kinas-mitogen signalering.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
