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Corantes FM na Reciclagem de Vesículas
 
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Corantes FM na Reciclagem de Vesículas

Overview

Os corantes FM são uma classe de moléculas fluorescentes que tem encontrado importante uso no estudo do processo de reciclagem de vesículas. Em virtude de uma estrutura química, essas moléculas podem inserir-se no folheto externo das membranas bicamadas fosfolipídicas. Após a inserção da membrana, eles são internalizados na célula através de vesículas endocitadas, e liberados quando essas vesículas reciclam de volta para a membrana. Uma vez que esses corantes fluorescem fortemente no ambiente hidrofóbico dentro das membranas e fracamente no compartimento extracelular, os níveis de fluorescência FM podem ser usados para rastrear a atividade vesicular durante todo o processo de reciclagem.

Este vídeo fornece uma introdução ao uso de corantes FM em experimentos destinados a examinar a reciclagem de vesículas. Primeiro revisamos a bioquímica dos corantes FM e como suas propriedades permitem seu uso nesses experimentos. Em seguida, passamos por um protocolo geral para o uso de corantes FM em tais estudos e, finalmente, discutimos algumas pesquisas recentes que fazem uso dessas moléculas únicas.

Procedure

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Corantes FM são corantes de membrana que são amplamente utilizados para a reciclagem de vesículas de imagem. Este é o processo pelo qual uma célula forma vesículas a partir de sua própria membrana para preservar o tamanho da célula, reutilizar proteínas caras e transportar moléculas consecutivamente para o espaço extracelular. Este processo é mais comumente estudado em sinapses neuronais, onde está envolvido na liberação de neurotransmissores. Além de examinar a reciclagem de vesículas, os corantes FM são usados para estudar vários outros fenômenos, como secreção em células cromafinas e reparação de membrana celular após lesão.

Este vídeo se concentrará no uso de corantes FM em um experimento que estuda a reciclagem de vesículas. Vamos passar por um protocolo passo-a-passo que usa corantes FM para quantificar o processo de reciclagem em neurônios estimulados. Por fim, vamos rever alguns experimentos de exemplo, que utilizam essa molécula única de diferentes maneiras.

Antes de entrar no procedimento, vamos primeiro rever as propriedades bioquímicas dos corantes FM, o que nos ajudará a entender sua função em experimentos de reciclagem de vesículas.

Estruturalmente, os corantes FM são moléculas de estiricos que derivam seu nome do cientista que as sintetizou — Fei Mao. Esses corantes têm três características estruturais principais: cabeça, cauda e ponte. A ponte consiste em dois anéis aromáticos com uma região variável de ligação dupla entre eles. Esta seção inteira cria o fluoróforo.

É a natureza de qualquer fluoróforo que quando atingido pela luz de entrada em um certo comprimento de onda de excitação, seus átomos absorvem essa energia e elevam seus elétrons para um estado animado. Esses elétrons retornam ao estado terrestre emitindo energia vibracionalmente, e finalmente como luz de um comprimento de onda de emissão. A cauda hidrofóbica permite que a molécula FM partisse nas bicamadas lipídicas da membrana celular, e sua cabeça hidrofílica tem uma carga que restringe sua localização ao folheto de membrana externa.

Portanto, a única maneira de entrar na célula é através da endocitose. Os corantes fm são extremamente sensíveis ao ambiente, e mostram fluorescência fraca em solventes polares, mas forte fluorescência em ambientes hidrofóbicos como membranas. Isso cria rotulagem de membrana de alto contraste que pode ser visualizada e quantificada usando um microscópio de fluorescência.

Essas propriedades tornam os corantes FM especificamente adequados para avaliar a reciclagem de vesículas em sinapses. Resumidamente, o processo envolve a incubação das culturas com corante FM. Algumas das moléculas fm se apegam às membranas, o que aumenta significativamente suas intensidades de fluorescência. Em seguida, um estímulo inicia o processo de internalização da membrana. Portanto, algumas moléculas FM estão presas na membrana vesícula, e o resto das moléculas de corante localizadas externas são lavadas.

Em segunda estimulação, vesículas manchadas internalizadas se fundem com a membrana celular para liberar seu conteúdo, e o corante rapidamente desparticiona, resultando em uma rápida diminuição da intensidade da fluorescência. Esta desinização pode ser quantificada com a ajuda de um microscópio de fluorescência.

Agora que você está familiarizado com os princípios bioquímicos dos corantes FM, vamos rever um procedimento sobre como realizar um experimento examinando a reciclagem de vesículas sináptica usando esses corantes.

Amostras limpas e saudáveis de culturas neuronais em deslizamentos de cobertura são preparadas com antecedência. Essas células são movidas para uma solução de corante FM, fazendo com que as membranas sejam rotuladas. A mancha de cobertura da amostra é então montada na câmara de imagem do microscópio.

Para permitir manipulações de fluidos como lavagens, as linhas de entrada e saída de fluidos são anexadas para formar uma câmara de perfusão selada. Monte a câmara no palco de um microscópio de fluorescência. Conecte os fios à câmara e conecte-os ao estimulador elétrico. Uma vez anexados, os filtros de excitação e emissão são definidos de acordo com o corante FM utilizado.

O carregamento de tingimento em vesículas via endocitose é induzido por uma estimulação elétrica. Após a estimulação, terminais nervosos podem se recuperar. Em seguida, o corante extracelular é lavado com tampão; isso também minimiza a fluorescência de fundo. É importante manter o mínimo de intensidade de excitação porque os corantes FM são propensos ao fotobleaching, que está enfraquecendo a intensidade da fluorescência devido à excitação prolongada. Após a breve incubação, as imagens iniciais são obtidas. Em seguida, a exoctose é induzida com um segundo sinal elétrico.

Depois de medir a fluorescência em diferentes pontos de tempo após a estimulação, no final, os terminais nervosos podem ser exaustivamente estimulados a descarregar todo o corante liberado. A fluorescência remanescente após isso é considerada como a intensidade de fluorescência de fundo. Em seguida, a fluorescência intrínseca de cada imagem é medida usando a ferramenta "Região de Interesse" em uma área não sináptica da imagem. A fluorescência de fundo e a fluorescência intrínseca é então subtraída da intensidade de fluorescência de cada ponto de tempo para obter intensidade de fluorescência normalizada, que é então plotada versus tempo. A diminuição da intensidade ao longo do tempo representa a desestabilização, que é uma medida indireta da reciclagem de vesículas.

Agora que revisamos a metodologia, vamos ver como os corantes FM são usados em experimentos específicos.

Discutimos o protocolo usando corantes FM em neurônios estimulados. Aqui, os cientistas estavam interessados em estudar a reciclagem espontânea de vesículas. Eles fizeram isso usando o protocolo estabelecido em combinação com um sistema de imagem sensível o suficiente para detectar pequenas alterações na intensidade da fluorescência. Os resultados representam uma diminuição da intensidade da fluorescência que se deve diretamente à liberação sináptica espontânea.

Dentro do neurônio pré-sináptico, as vesículas são divididas em duas piscinas: uma piscina de reserva ou RP, e uma piscina prontamente liberada ou RRP. Aqui, os cientistas usaram corantes FM para analisar a fração de cada tipo na população vesícula. Pela aplicação sequencial de estímulos elétricos de intensidades crescentes, esses cientistas foram capazes de quantificar os percentuais relativos de cada tipo de piscina vesícula.

Por fim, o biólogo celular também usa corantes FM para dissecar fatores envolvidos no reparo exociótico de membranas plasmáticas feridas. Neste experimento, os pesquisadores foram particularmente focados no papel da sphingomyelinase, uma enzima modificadora de lipídios, no processo de ressequeling da membrana. Primeiro, eles geraram células deficientes na enzima sphingomyelinase com a ajuda de silenciar o tratamento de RNA. Em seguida, trataram essas células e um grupo controle com corante FM exógeno e uma toxina que cria lesões de membrana plasmática. Finalmente, eles viram todas as amostras usando um microscópio confocal. Os resultados mostraram que as células deficientes de sphingomyelinase apresentaram acúmulo robusto de moléculas fm intracelulares. Por outro lado, as células de controle apresentaram um fluxo fm mínimo, sugerindo um papel de sphingomyelinase na reparação da membrana plasmática.

Você acabou de assistir o vídeo da JoVE sobre corantes FM na reciclagem de vesículas. O vídeo descreveu a bioquímica dos corantes FM, detalhou um protocolo para manchar e quantificar a reciclagem de vesículas sináptica, e finalmente esboçou experimentos atuais utilizando esses corantes de diferentes maneiras. Como sempre, obrigado por assistir!

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