Overview
מדידת הריכוז היא צעד בסיסי של מעש ביוכימי רבים. קביעת חלבונים פוטומטריים מנצלת את העובדה שכ ככל שדגימה מכילה יותר חומרים סופגי אור, כך האור ישדר דרכה פחות. מאז הקשר בין ריכוז וספיגה הוא ליניארי, תופעה זו יכולה לשמש כדי למדוד את הריכוז בדגימות שבו הוא לא ידוע.
סרטון זה מתאר את היסודות של קביעת חלבונים פוטומטריים ומציג את ברדפורד אסאי ואת שיטת לאורי. ההליך בסרטון יכסה מראייה טיפוסית של ברדפורד. היישומים המכוסים כוללים מדידה ישירה של כמויות קטנות מאוד של חומצות גרעין כדי לאפיין ריכוז וטוהר, קביעת יעילות צימוד של חומר ביו-מימטי, וריאציה נוספת של קביעת חלבון פוטומטרי באמצעות צבע Remazol.
קביעת הריכוז של חלבון בדגימות היא צעד בסיסי בבחונים ביוכימיים רבים. קביעה פוטומטרית יכולה להיעשות עם גדלי מדגם קטנים. ככל שדגימה מכילה יותר חומרים סופגי אור, כך האור ישדר דרכה פחות. זה מספק מדידה כמותית של החומרים סופגים. מושגים אלה הם כל כך בסיסיים למדע כי המאמרים שהציג שתיים מהטכניקות הם בשלושת המאמרים המצוטטים ביותר בכל הזמנים. סרטון זה יציג את המושגים שמאחורי כמה מהטכניקות הנפוצות ביותר לקביעת חלבונים פוטומטריים, כיצד הם מבוצעים וכיצד מנתחים את הנתונים שנאספו.
קביעת חלבונים פוטומטריים מבוססת על הקשר בין ריכוז לספיגת אור. זה ידוע בשם חוק באר-למברט, הקובע כי ריכוז של מין סופג אור הוא פרופורציונלי לספיגתו.
עיקרון זה עומד בבסיס כל שיטות קביעת החלבון הפוטומטרי.
לניתוח ספיגה ישיר, נמדדים ערכי הספיגה של דגימות חלבון ללא טעם. בגלל שרשראות הצד הארומטיות שלהם, שאריות טריפטופן ו טירוזין נותנות את קריאות הספיגה הגבוהות ביותר אורך גל של 280 ננומטר.
עם זאת, חומצות אמינו אלה - שהן שתיים מהפחות שכיחות שנמצאות בחלבונים - נמצאות בכמויות שונות בכל חלבון, כך שכל קביעה היא ייחודית. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחו בוצעו מעשים מורכבים יותר שאינם תלויים בחומצות אמינו אלה.
דוגמה אחת היא ברדפורד אסאי, שבו צבע צבעוני מתווסף לדגימה. הצבע, המכונה Coomassie כחול, מגיב באופן יחסי - יותר חלבון נוכח, אירועים מחייבים יותר עם הצבע.
לאחר מכן, ריכוז החלבון נקבע על ידי מדידת הספיגה של הצבע הכחול הקומאסי הכבול, אשר סופג אור ב 594 ננומטר. עם זאת, הבדיקה ברדפורד היא ליניארית על פני טווח קצר של ריכוזים, ולכן דילול נדרשים לעתים קרובות לפני הניתוח.
שיטת לאורי משלבת את ריאגנט ביורט, פתרון אלקליין של יונים מנחושת המגיבים עם קשרים פפטידים, ואת ריאגנט פולין-Ciocâlteu, אשר מחמצן שאריות חלבון ארומטי. שינוי הצבע המתקבל של המדגם הוא פרופורציונלי לריכוז החלבון.
הספיגה של ריאגנט פולין מופחת ניתן לקבוע ב 750 ננומטר. כמו ספיגה ישירה, לכל חלבון יש תגובה ייחודית, ויש לכייל אותו לחלבון מעניין. עכשיו שבדקנו את העקרונות הבסיסיים מאחורי כמה מההבחנות הנפוצות ביותר, בואו נסתכל על האופן שבו מתבצעים ספיגה ישירה ובדיקת ברדפורד.
כדי להתחיל בניתוח ספיגה ישיר, הספקטרופוטומטר מכויל עם ריק כדי לקבוע אפס ספיגה. פתרונות סטנדרטיים מוכנים לשימוש ביצירת עקומת הכיול. לאחר מכן, aliquot של התקן הראשון מתווסף cuvette, ומושם לתוך ספקטרופוטומטר.
ערך הספיגה ב- 280 ננומטר נרשם לאחר מכן. תהליך זה חוזר על עצמו עבור כל תקן, תוך שימוש ב- cuvette נקי עבור כל ריצה. לאחר השלמת, עקומת כיול נוצרת על ידי התוויית הספיגה לעומת הריכוז. השיפוע של קו זה הוא מקדם ההנחיה הטוחנת, המתייחס לספיגה לריכוז.
לאחר מכן, המדגם הלא ידוע נוסף ל- cuvette, וערך הספיגה נרשם. מכיוון שניתוח הנתונים של שיטות הקביעה הפוטומטריות השונות דומה, אנחנו נכסה את זה אחרי שנסתכל על הבדיקה של ברדפורד.
כאן, ברדפורד חלבון אסאי מבוצע עם תקן BSA על צלחת 96 טוב. בתור התחלה, פתרונות מלאי BSA מוכנים.
הפתרונות הלא ידועים מדוללים במים דה-יונים כדי להבטיח שהריכוזים נמצאים בטווח של ההסתה. בהתאם לערכה, צבע הקומאסי עשוי גם לדרוש דילול. לאחר מכן, עקומת הכיול מוגדרת על-ידי הוספת תקני BSA ללוח 96-well.
מים דה-יעו"ד מתווספים כדי להגיע לריכוז הדרוש כדי ליצור עקומה סטנדרטית. יש להוסיף את הדגימה הלא ידועה לצלחת במשולשים כדי להבטיח מדידה מדויקת. צבע קומאסי מתווסף לאחר מכן לכל באר, מתערבב עם הפיפטה.
מים דה-יעוניים מתווספים לבאר ריקה כמו ריקה, כדי למדוד את הספיגה. לאחר המתנה של 5 דקות עד שהצבע ייקשר, הספיגה נמדדת בקורא לוחות ב-590 ננומטר.
עכשיו שביצענו כמה מבדקים, בואו נבדוק איך לנתח את הנתונים. כל שיטת קביעת חלבונים פוטומטרית מבוססת על חוק באר למברט.
הספיגה הנמדדת של הסטנדרטים משמשת ליצירת עקומת כיול, המשמשת לאחר מכן לקביעת ריכוז הדגימות הלא ידועות. ניתן להתוות עקומה זו באופן ידני, אם כי כלים ספקטרופוטומטריים חדשים יותר ייצרו את עקומת הכיול לאחר שכל התקנים נמדדו. מערכות אלה גם לחשב ריכוז חלבון כמו דגימות לא ידועות מנותחים.
כעת, לאחר שבדקנו כיצד לנתח נתוני קביעת חלבונים פוטומטריים, בואו נבחן כמה מהדרכים שבהן נעשה שימוש בהליכים אלה.
העקרונות של קביעת חלבון פוטומטרי יכולים לשמש גם למדידת ריכוז חומצות גרעין ישירות. ספקטרופוטומטר הננו-טיפה מקבל דגימות של נפח קטן מאוד על הדוכן הפעיל אופטית. הספיגה נמדדת לאחר מכן, והמערכת קובעת באופן אוטומטי את ריכוז חומצת הגרעין. מכיוון שחלבונים ומקורות אחרים יכולים להפריע למדידות, טוהר הדגימה נקבע על ידי ניתוח יחסי הספיגה של 260 עד 280 ננומטר ו-260 עד 230 ננומטר. חומצות גרעין טהורות בדרך כלל מניבות יחסי תשואה של כ-1.8 וכ-2.0 לדנ"א ולרנ"א, בהתאמה.
קביעת חלבון פוטומטרי יכולה לשמש גם בייצור של חומרים ביו-מימטיים, אשר בהשראת הטבע כדי לעורר תגובות תאיות ספציפיות. דבקים רקומביננטיים קשורים חרוזי פוליסטירן כדי לדמות התקשרות חיידקית לתאים מארחים. בדיקת ברדפורד משמשת כדי לקבוע את יעילות הצימוד של הידבקות רקומביננטית החרוזים בייצור של החומר הביומימטי.
ניתן להשתמש בגילוי ואפיון של מיקרוביאלים של חלבונים. צבע R כחול מבריק Remazol הוא מלוכד באופן קוולנטי לחיידקים מוכי חום. החלבון אנטי מיקרוביאל הוא דגירה בתמיסה צבועה. לאחר מכן, המדגם הוא צנטריפוגה, ואת הספיגה של supernatant ב 595 ננומטר נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרופלסטיק. ספיגה מוגברת, על ידי הצבע המסיס ששוחרר לתוך supernatant מן החיידקים המסומנים, היא מדידה כמותית של פעילות אנזימטית.
הרגע צפיתם בסרטון של JoVE על קביעת חלבונים פוטומטריים. סרטון זה תיאר את העקרונות הבסיסיים של נחישות פוטומטרית, עבר על נהלים כלליים עבור כמה מותחות נפוצות, וכיסה כמה התפתחויות חדשות בטכניקות. תודה שצפיתם!
Procedure
מדידת הריכוז היא צעד בסיסי של מעש ביוכימי רבים. קביעת חלבונים פוטומטריים מנצלת את העובדה שכ ככל שדגימה מכילה יותר חומרים סופגי אור, כך האור ישדר דרכה פחות. מאז הקשר בין ריכוז וספיגה הוא ליניארי, תופעה זו יכולה לשמש כדי למדוד את הריכוז בדגימות שבו הוא לא ידוע.
סרטון זה מתאר את היסודות של קביעת חלבונים פוטומטריים ומציג את ברדפורד אסאי ואת שיטת לאורי. ההליך בסרטון יכסה מראייה טיפוסית של ברדפורד. היישומים המכוסים כוללים מדידה ישירה של כמויות קטנות מאוד של חומצות גרעין כדי לאפיין ריכוז וטוהר, קביעת יעילות צימוד של חומר ביו-מימטי, וריאציה נוספת של קביעת חלבון פוטומטרי באמצעות צבע Remazol.
קביעת הריכוז של חלבון בדגימות היא צעד בסיסי בבחונים ביוכימיים רבים. קביעה פוטומטרית יכולה להיעשות עם גדלי מדגם קטנים. ככל שדגימה מכילה יותר חומרים סופגי אור, כך האור ישדר דרכה פחות. זה מספק מדידה כמותית של החומרים סופגים. מושגים אלה הם כל כך בסיסיים למדע כי המאמרים שהציג שתיים מהטכניקות הם בשלושת המאמרים המצוטטים ביותר בכל הזמנים. סרטון זה יציג את המושגים שמאחורי כמה מהטכניקות הנפוצות ביותר לקביעת חלבונים פוטומטריים, כיצד הם מבוצעים וכיצד מנתחים את הנתונים שנאספו.
קביעת חלבונים פוטומטריים מבוססת על הקשר בין ריכוז לספיגת אור. זה ידוע בשם חוק באר-למברט, הקובע כי ריכוז של מין סופג אור הוא פרופורציונלי לספיגתו.
עיקרון זה עומד בבסיס כל שיטות קביעת החלבון הפוטומטרי.
לניתוח ספיגה ישיר, נמדדים ערכי הספיגה של דגימות חלבון ללא טעם. בגלל שרשראות הצד הארומטיות שלהם, שאריות טריפטופן ו טירוזין נותנות את קריאות הספיגה הגבוהות ביותר אורך גל של 280 ננומטר.
עם זאת, חומצות אמינו אלה - שהן שתיים מהפחות שכיחות שנמצאות בחלבונים - נמצאות בכמויות שונות בכל חלבון, כך שכל קביעה היא ייחודית. כדי להתגבר על מגבלה זו, פותחו בוצעו מעשים מורכבים יותר שאינם תלויים בחומצות אמינו אלה.
דוגמה אחת היא ברדפורד אסאי, שבו צבע צבעוני מתווסף לדגימה. הצבע, המכונה Coomassie כחול, מגיב באופן יחסי - יותר חלבון נוכח, אירועים מחייבים יותר עם הצבע.
לאחר מכן, ריכוז החלבון נקבע על ידי מדידת הספיגה של הצבע הכחול הקומאסי הכבול, אשר סופג אור ב 594 ננומטר. עם זאת, הבדיקה ברדפורד היא ליניארית על פני טווח קצר של ריכוזים, ולכן דילול נדרשים לעתים קרובות לפני הניתוח.
שיטת לאורי משלבת את ריאגנט ביורט, פתרון אלקליין של יונים מנחושת המגיבים עם קשרים פפטידים, ואת ריאגנט פולין-Ciocâlteu, אשר מחמצן שאריות חלבון ארומטי. שינוי הצבע המתקבל של המדגם הוא פרופורציונלי לריכוז החלבון.
הספיגה של ריאגנט פולין מופחת ניתן לקבוע ב 750 ננומטר. כמו ספיגה ישירה, לכל חלבון יש תגובה ייחודית, ויש לכייל אותו לחלבון מעניין. עכשיו שבדקנו את העקרונות הבסיסיים מאחורי כמה מההבחנות הנפוצות ביותר, בואו נסתכל על האופן שבו מתבצעים ספיגה ישירה ובדיקת ברדפורד.
כדי להתחיל בניתוח ספיגה ישיר, הספקטרופוטומטר מכויל עם ריק כדי לקבוע אפס ספיגה. פתרונות סטנדרטיים מוכנים לשימוש ביצירת עקומת הכיול. לאחר מכן, aliquot של התקן הראשון מתווסף cuvette, ומושם לתוך ספקטרופוטומטר.
ערך הספיגה ב- 280 ננומטר נרשם לאחר מכן. תהליך זה חוזר על עצמו עבור כל תקן, תוך שימוש ב- cuvette נקי עבור כל ריצה. לאחר השלמת, עקומת כיול נוצרת על ידי התוויית הספיגה לעומת הריכוז. השיפוע של קו זה הוא מקדם ההנחיה הטוחנת, המתייחס לספיגה לריכוז.
לאחר מכן, המדגם הלא ידוע נוסף ל- cuvette, וערך הספיגה נרשם. מכיוון שניתוח הנתונים של שיטות הקביעה הפוטומטריות השונות דומה, אנחנו נכסה את זה אחרי שנסתכל על הבדיקה של ברדפורד.
כאן, ברדפורד חלבון אסאי מבוצע עם תקן BSA על צלחת 96 טוב. בתור התחלה, פתרונות מלאי BSA מוכנים.
הפתרונות הלא ידועים מדוללים במים דה-יונים כדי להבטיח שהריכוזים נמצאים בטווח של ההסתה. בהתאם לערכה, צבע הקומאסי עשוי גם לדרוש דילול. לאחר מכן, עקומת הכיול מוגדרת על-ידי הוספת תקני BSA ללוח 96-well.
מים דה-יעו"ד מתווספים כדי להגיע לריכוז הדרוש כדי ליצור עקומה סטנדרטית. יש להוסיף את הדגימה הלא ידועה לצלחת במשולשים כדי להבטיח מדידה מדויקת. צבע קומאסי מתווסף לאחר מכן לכל באר, מתערבב עם הפיפטה.
מים דה-יעוניים מתווספים לבאר ריקה כמו ריקה, כדי למדוד את הספיגה. לאחר המתנה של 5 דקות עד שהצבע ייקשר, הספיגה נמדדת בקורא לוחות ב-590 ננומטר.
עכשיו שביצענו כמה מבדקים, בואו נבדוק איך לנתח את הנתונים. כל שיטת קביעת חלבונים פוטומטרית מבוססת על חוק באר למברט.
הספיגה הנמדדת של הסטנדרטים משמשת ליצירת עקומת כיול, המשמשת לאחר מכן לקביעת ריכוז הדגימות הלא ידועות. ניתן להתוות עקומה זו באופן ידני, אם כי כלים ספקטרופוטומטריים חדשים יותר ייצרו את עקומת הכיול לאחר שכל התקנים נמדדו. מערכות אלה גם לחשב ריכוז חלבון כמו דגימות לא ידועות מנותחים.
כעת, לאחר שבדקנו כיצד לנתח נתוני קביעת חלבונים פוטומטריים, בואו נבחן כמה מהדרכים שבהן נעשה שימוש בהליכים אלה.
העקרונות של קביעת חלבון פוטומטרי יכולים לשמש גם למדידת ריכוז חומצות גרעין ישירות. ספקטרופוטומטר הננו-טיפה מקבל דגימות של נפח קטן מאוד על הדוכן הפעיל אופטית. הספיגה נמדדת לאחר מכן, והמערכת קובעת באופן אוטומטי את ריכוז חומצת הגרעין. מכיוון שחלבונים ומקורות אחרים יכולים להפריע למדידות, טוהר הדגימה נקבע על ידי ניתוח יחסי הספיגה של 260 עד 280 ננומטר ו-260 עד 230 ננומטר. חומצות גרעין טהורות בדרך כלל מניבות יחסי תשואה של כ-1.8 וכ-2.0 לדנ"א ולרנ"א, בהתאמה.
קביעת חלבון פוטומטרי יכולה לשמש גם בייצור של חומרים ביו-מימטיים, אשר בהשראת הטבע כדי לעורר תגובות תאיות ספציפיות. דבקים רקומביננטיים קשורים חרוזי פוליסטירן כדי לדמות התקשרות חיידקית לתאים מארחים. בדיקת ברדפורד משמשת כדי לקבוע את יעילות הצימוד של הידבקות רקומביננטית החרוזים בייצור של החומר הביומימטי.
ניתן להשתמש בגילוי ואפיון של מיקרוביאלים של חלבונים. צבע R כחול מבריק Remazol הוא מלוכד באופן קוולנטי לחיידקים מוכי חום. החלבון אנטי מיקרוביאל הוא דגירה בתמיסה צבועה. לאחר מכן, המדגם הוא צנטריפוגה, ואת הספיגה של supernatant ב 595 ננומטר נמדד באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרופלסטיק. ספיגה מוגברת, על ידי הצבע המסיס ששוחרר לתוך supernatant מן החיידקים המסומנים, היא מדידה כמותית של פעילות אנזימטית.
הרגע צפיתם בסרטון של JoVE על קביעת חלבונים פוטומטריים. סרטון זה תיאר את העקרונות הבסיסיים של נחישות פוטומטרית, עבר על נהלים כלליים עבור כמה מותחות נפוצות, וכיסה כמה התפתחויות חדשות בטכניקות. תודה שצפיתם!
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לא הוכרזו ניגודי אינטרסים.
