Overview
농도를 측정하는 것은 많은 생화학 적 분석을 근본적인 단계입니다. 포토메트릭 단백질 결정은 샘플에 광 흡수 물질을 더 많이 함유하고 있다는 사실을 활용하며, 빛이 이를 통해 전달되는 빛이 적다는 사실을 활용합니다. 농도와 흡수 사이의 관계가 선형이기 때문에, 이 현상은 알려지지 않은 견본에 있는 농도를 측정하기 위하여 이용될 수 있습니다.
이 비디오는 포토메트릭 단백질 측정의 기초를 설명하고 브래드포드 분석과 로리 방법을 소개합니다. 비디오의 절차는 전형적인 브래드포드 분석체를 다룰 것입니다. 적용 대상에는 농도와 순도를 특성화하기 위해 매우 적은 양의 핵산을 직접 측정하고, 생체 모방 물질의 결합 효율 결정, Remazol 염료를 이용한 광측정 단백질 측정의 또 다른 변형이 포함됩니다.
시료에서 단백질의 농도를 결정하는 것은 많은 생화학 적 분석을 위한 근본적인 단계입니다. 작은 샘플 크기로 포토메트릭 측정을 수행할 수 있습니다. 시료에 광 흡수 물질이 많을수록 빛이 이를 통해 전달되는 것이 줄어듭니다. 이것은 흡수 물질의 정량적 측정을 제공합니다. 이러한 개념은 과학의 근간이 되어 두 가지 기술을 도입한 논문이 역대 가장 많이 인용된 논문 3개에 있습니다. 이 비디오는 가장 일반적인 포토메트릭 단백질 측정 기술, 수행 방법 및 수집된 데이터를 분석하는 방법의 개념을 보여줍니다.
포토메트릭 단백질 결정은 농도와 광 흡수성 사이의 관계를 기반으로 합니다. 이것은 빛 흡수 종의 농도가 그것의 흡수에 비례한다는 것을 명시하는 맥주 램버트 법으로 알려져 있습니다.
이 원리는 모든 광측정 단백질 결정 방법의 기초입니다.
직접 흡수 분석을 위해 변경되지 않은 단백질 샘플의 흡광도 값을 측정합니다. 방향족 측면 체인으로 인해 트립토판과 티로신 잔류물은 280 nm의 파장에서 가장 높은 흡광도 판독값을 제공합니다.
그러나, 단백질에서 가장 빈번하게 발견되는 아미노산은 모든 단백질의 양에 존재하므로 각 결정은 독특합니다. 이 한계를 극복하기 위해, 이러한 아미노산에 의존하지 않는 더 복잡한 분석 - 개발되었다.
한 가지 예는 브래드포드 분석( Bradford Assay)으로, 여기에는 색염료가 샘플에 추가됩니다. 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 알려진 염료는 염료와 함께 더 많은 결합 이벤트가 존재하는 비례적으로 반응합니다.
이어서, 단백질 농도는 594nm에서 빛을 흡수하는 바운드 쿠마시 블루 염료의 흡수를 측정하여 결정된다. 그러나, 브래드포드 분석 농도의 짧은 범위에 선형, 그래서 희석종종 분석 하기 전에 필요.
Lowry Method는 펩타이드 결합과 반응하는 구리 이온의 알칼리성 용액인 비우레트 시약과 방향족 단백질 잔류물을 산화하는 Folin-Ciocâlteu 시약을 결합합니다. 시료의 결과 색상 변화는 단백질 농도에 비례한다.
감소된 Folin 시약의 흡수도는 750 nm에서 결정될 수 있다. 직접 흡수와 마찬가지로, 각 단백질은 독특한 반응을 가지며 관심 있는 단백질을 위해 보정되어야 합니다. 이제 우리는 가장 일반적인 분석의 뒤에 기본 원칙을 검토했습니다, 직접 흡수와 브래드포드 분석이 수행되는 방법을 살펴 보자.
직접 흡수 분석을 시작하려면 분광광계가 빈 으로 보정되어 흡수도가 0으로 결정됩니다. 표준 솔루션은 교정 곡선을 만드는 데 사용할 준비가 되어 있습니다. 그런 다음 첫 번째 표준의 알리쿼트가 큐벳에 추가되어 분광계에 배치됩니다.
그런 다음 280 nm의 흡광도 값을 기록합니다. 이 프로세스는 각 실행에 대해 깨끗한 큐벳을 사용하여 각 표준에 대해 반복됩니다. 완료되면 흡광도 와 농도를 플로팅하여 교정 곡선이 만들어집니다. 이 선의 경사는 흡수도를 농도에 관한 어금니 감쇠 계수입니다.
다음으로, 알 수 없는 샘플이 큐벳에 첨가되고 흡수도 값이 기록됩니다. 다른 포토메트릭 결정 방법에 대한 데이터 분석이 유사하기 때문에 브래드포드 분석을 살펴본 후에 이를 다룰 것입니다.
여기서, 브래드포드 단백질 분석은 96웰 플레이트에 BSA 표준으로 수행됩니다. 우선 BSA 재고 솔루션이 준비됩니다.
알 수 없는 솔루션은 농도가 분석 범위 내에 있는지 확인하기 위해 탈이온화된 물로 희석됩니다. 키트에 따라 쿠마시 염료에는 희석이 필요할 수도 있습니다. 그런 다음 교정 곡선은 BSA 표준을 96웰 플레이트에 추가하여 설정됩니다.
표준 곡선을 생성하기 위해 필요한 농도에 도달하기 위해 염분물이 첨가됩니다. 정확한 측정을 위해 알 수 없는 샘플을 트리플리케이터의 플레이트에 추가해야 합니다. 쿠마시 염료는 다음 각 우물에 추가되어 파이펫과 혼합됩니다.
분산된 물은 빈 우물뿐만 아니라 흡광도를 측정하기 위해 빈 물에 첨가됩니다. 염료가 결합될 때까지 5분 간 기다린 후, 흡광도는 590nm의 플레이트 리더기에서 측정됩니다.
이제 몇 가지 분석을 수행했습니다. 각 포토메트릭 단백질 결정 방법은 맥주-램버트 법칙을 기반으로 합니다.
표준의 측정 된 흡수는 교정 곡선을 만드는 데 사용되며, 이는 알 수없는 샘플의 농도를 결정하는 데 사용됩니다. 이 곡선은 수동으로 플롯할 수 있지만 최신 분광 측정 도구는 모든 표준을 측정하면 교정 곡선을 만듭니다. 이러한 시스템은 또한 알 수 없는 견본이 분석될 때 단백질 농도를 계산할 것입니다.
이제 포토메트릭 단백질 결정 데이터를 분석하는 방법을 검토한 결과, 이러한 절차가 사용되는 몇 가지 방법을 살펴보겠습니다.
포토메트릭 단백질 결정의 원리는 또한 핵산 농도를 직접 측정하는 데 사용될 수 있다. 나노방울 분광광계는 광학 활성 받침대에 매우 작은 양의 샘플을 허용합니다. 그런 다음 흡광도를 측정하고 시스템은 핵산 농도를 자동으로 결정합니다. 단백질 및 기타 소스가 측정을 방해할 수 있기 때문에 260 nm 및 260 nm 에서 230 nm 흡광도 비율을 분석하여 시료 순도가 결정됩니다. 순수 핵산은 전형적으로 DNA와 RNA를 위한 대략 1.8 및 대략 2.0의 수율 비율을, 각각.
포토메트릭 단백질 결정은 또한 특정 세포 반응을 유도하기 위하여 자연에서 영감을 받은 생체 모방 물질의 생산에 이용될 수 있습니다. 재조합 접착제는 숙주 세포에 세균 부착을 시뮬레이션하기 위해 폴리스티렌 구슬에 바인딩됩니다. 브래드포드 분석은 생체 모방 물질의 생산에서 구슬에 재조합 접착의 결합 효율을 결정하는 데 사용됩니다.
대체 광측정 단백질 분석은 단백질 항균제의 검출 및 특성화에 사용될 수 있다. 레마졸 화려한 블루 R 염료는 열로 죽은 박테리아에 공유 결합된다. 단백질 항균은 염색된 용액에서 배양됩니다. 이어서, 시료는 원심분리되고, 595nm에서 상피물의 흡광도는 마이크로플레이트 분광광계를 이용하여 측정된다. 증가된 흡광도는, 표지된 박테리아로부터 상수체로 방출되는 수용성 염료에 의한, 효소 활성의 정량적 측정이다.
포토메트릭 단백질 측정에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이 비디오는 포토메트릭 결정의 기본 원리를 설명하고, 몇 가지 일반적인 분석법에 대한 일반적인 절차를 거쳤으며, 기술의 새로운 발전을 다루었습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
Procedure
농도를 측정하는 것은 많은 생화학 적 분석을 근본적인 단계입니다. 포토메트릭 단백질 결정은 샘플에 광 흡수 물질을 더 많이 함유하고 있다는 사실을 활용하며, 빛이 이를 통해 전달되는 빛이 적다는 사실을 활용합니다. 농도와 흡수 사이의 관계가 선형이기 때문에, 이 현상은 알려지지 않은 견본에 있는 농도를 측정하기 위하여 이용될 수 있습니다.
이 비디오는 포토메트릭 단백질 측정의 기초를 설명하고 브래드포드 분석과 로리 방법을 소개합니다. 비디오의 절차는 전형적인 브래드포드 분석체를 다룰 것입니다. 적용 대상에는 농도와 순도를 특성화하기 위해 매우 적은 양의 핵산을 직접 측정하고, 생체 모방 물질의 결합 효율 결정, Remazol 염료를 이용한 광측정 단백질 측정의 또 다른 변형이 포함됩니다.
시료에서 단백질의 농도를 결정하는 것은 많은 생화학 적 분석을 위한 근본적인 단계입니다. 작은 샘플 크기로 포토메트릭 측정을 수행할 수 있습니다. 시료에 광 흡수 물질이 많을수록 빛이 이를 통해 전달되는 것이 줄어듭니다. 이것은 흡수 물질의 정량적 측정을 제공합니다. 이러한 개념은 과학의 근간이 되어 두 가지 기술을 도입한 논문이 역대 가장 많이 인용된 논문 3개에 있습니다. 이 비디오는 가장 일반적인 포토메트릭 단백질 측정 기술, 수행 방법 및 수집된 데이터를 분석하는 방법의 개념을 보여줍니다.
포토메트릭 단백질 결정은 농도와 광 흡수성 사이의 관계를 기반으로 합니다. 이것은 빛 흡수 종의 농도가 그것의 흡수에 비례한다는 것을 명시하는 맥주 램버트 법으로 알려져 있습니다.
이 원리는 모든 광측정 단백질 결정 방법의 기초입니다.
직접 흡수 분석을 위해 변경되지 않은 단백질 샘플의 흡광도 값을 측정합니다. 방향족 측면 체인으로 인해 트립토판과 티로신 잔류물은 280 nm의 파장에서 가장 높은 흡광도 판독값을 제공합니다.
그러나, 단백질에서 가장 빈번하게 발견되는 아미노산은 모든 단백질의 양에 존재하므로 각 결정은 독특합니다. 이 한계를 극복하기 위해, 이러한 아미노산에 의존하지 않는 더 복잡한 분석 - 개발되었다.
한 가지 예는 브래드포드 분석( Bradford Assay)으로, 여기에는 색염료가 샘플에 추가됩니다. 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 알려진 염료는 염료와 함께 더 많은 결합 이벤트가 존재하는 비례적으로 반응합니다.
이어서, 단백질 농도는 594nm에서 빛을 흡수하는 바운드 쿠마시 블루 염료의 흡수를 측정하여 결정된다. 그러나, 브래드포드 분석 농도의 짧은 범위에 선형, 그래서 희석종종 분석 하기 전에 필요.
Lowry Method는 펩타이드 결합과 반응하는 구리 이온의 알칼리성 용액인 비우레트 시약과 방향족 단백질 잔류물을 산화하는 Folin-Ciocâlteu 시약을 결합합니다. 시료의 결과 색상 변화는 단백질 농도에 비례한다.
감소된 Folin 시약의 흡수도는 750 nm에서 결정될 수 있다. 직접 흡수와 마찬가지로, 각 단백질은 독특한 반응을 가지며 관심 있는 단백질을 위해 보정되어야 합니다. 이제 우리는 가장 일반적인 분석의 뒤에 기본 원칙을 검토했습니다, 직접 흡수와 브래드포드 분석이 수행되는 방법을 살펴 보자.
직접 흡수 분석을 시작하려면 분광광계가 빈 으로 보정되어 흡수도가 0으로 결정됩니다. 표준 솔루션은 교정 곡선을 만드는 데 사용할 준비가 되어 있습니다. 그런 다음 첫 번째 표준의 알리쿼트가 큐벳에 추가되어 분광계에 배치됩니다.
그런 다음 280 nm의 흡광도 값을 기록합니다. 이 프로세스는 각 실행에 대해 깨끗한 큐벳을 사용하여 각 표준에 대해 반복됩니다. 완료되면 흡광도 와 농도를 플로팅하여 교정 곡선이 만들어집니다. 이 선의 경사는 흡수도를 농도에 관한 어금니 감쇠 계수입니다.
다음으로, 알 수 없는 샘플이 큐벳에 첨가되고 흡수도 값이 기록됩니다. 다른 포토메트릭 결정 방법에 대한 데이터 분석이 유사하기 때문에 브래드포드 분석을 살펴본 후에 이를 다룰 것입니다.
여기서, 브래드포드 단백질 분석은 96웰 플레이트에 BSA 표준으로 수행됩니다. 우선 BSA 재고 솔루션이 준비됩니다.
알 수 없는 솔루션은 농도가 분석 범위 내에 있는지 확인하기 위해 탈이온화된 물로 희석됩니다. 키트에 따라 쿠마시 염료에는 희석이 필요할 수도 있습니다. 그런 다음 교정 곡선은 BSA 표준을 96웰 플레이트에 추가하여 설정됩니다.
표준 곡선을 생성하기 위해 필요한 농도에 도달하기 위해 염분물이 첨가됩니다. 정확한 측정을 위해 알 수 없는 샘플을 트리플리케이터의 플레이트에 추가해야 합니다. 쿠마시 염료는 다음 각 우물에 추가되어 파이펫과 혼합됩니다.
분산된 물은 빈 우물뿐만 아니라 흡광도를 측정하기 위해 빈 물에 첨가됩니다. 염료가 결합될 때까지 5분 간 기다린 후, 흡광도는 590nm의 플레이트 리더기에서 측정됩니다.
이제 몇 가지 분석을 수행했습니다. 각 포토메트릭 단백질 결정 방법은 맥주-램버트 법칙을 기반으로 합니다.
표준의 측정 된 흡수는 교정 곡선을 만드는 데 사용되며, 이는 알 수없는 샘플의 농도를 결정하는 데 사용됩니다. 이 곡선은 수동으로 플롯할 수 있지만 최신 분광 측정 도구는 모든 표준을 측정하면 교정 곡선을 만듭니다. 이러한 시스템은 또한 알 수 없는 견본이 분석될 때 단백질 농도를 계산할 것입니다.
이제 포토메트릭 단백질 결정 데이터를 분석하는 방법을 검토한 결과, 이러한 절차가 사용되는 몇 가지 방법을 살펴보겠습니다.
포토메트릭 단백질 결정의 원리는 또한 핵산 농도를 직접 측정하는 데 사용될 수 있다. 나노방울 분광광계는 광학 활성 받침대에 매우 작은 양의 샘플을 허용합니다. 그런 다음 흡광도를 측정하고 시스템은 핵산 농도를 자동으로 결정합니다. 단백질 및 기타 소스가 측정을 방해할 수 있기 때문에 260 nm 및 260 nm 에서 230 nm 흡광도 비율을 분석하여 시료 순도가 결정됩니다. 순수 핵산은 전형적으로 DNA와 RNA를 위한 대략 1.8 및 대략 2.0의 수율 비율을, 각각.
포토메트릭 단백질 결정은 또한 특정 세포 반응을 유도하기 위하여 자연에서 영감을 받은 생체 모방 물질의 생산에 이용될 수 있습니다. 재조합 접착제는 숙주 세포에 세균 부착을 시뮬레이션하기 위해 폴리스티렌 구슬에 바인딩됩니다. 브래드포드 분석은 생체 모방 물질의 생산에서 구슬에 재조합 접착의 결합 효율을 결정하는 데 사용됩니다.
대체 광측정 단백질 분석은 단백질 항균제의 검출 및 특성화에 사용될 수 있다. 레마졸 화려한 블루 R 염료는 열로 죽은 박테리아에 공유 결합된다. 단백질 항균은 염색된 용액에서 배양됩니다. 이어서, 시료는 원심분리되고, 595nm에서 상피물의 흡광도는 마이크로플레이트 분광광계를 이용하여 측정된다. 증가된 흡광도는, 표지된 박테리아로부터 상수체로 방출되는 수용성 염료에 의한, 효소 활성의 정량적 측정이다.
포토메트릭 단백질 측정에 대한 JoVE의 비디오를 방금 시청했습니다. 이 비디오는 포토메트릭 결정의 기본 원리를 설명하고, 몇 가지 일반적인 분석법에 대한 일반적인 절차를 거쳤으며, 기술의 새로운 발전을 다루었습니다. 시청해 주셔서 감사합니다!
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Disclosures
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
