Aislamiento de células Decidual humanas primarias de las membranas fetales de la placenta de término

El objetivo general de este protocolo de aislamiento celular es desarrollar un método para aislar células deciduales primarias con viabilidad de celda final de alto rendimiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reproducción humana, como el papel caducifolio en la implantación de blastocistos y el inicio del parto. También puede proporcionar información sobre diversas patologías relacionadas con el embarazo.

La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método eficaz en tiempo y costo para el aislamiento de células deciduales primarias con altos rendimientos finales de viabilidad. Para empezar, deje cinco tubos de 50 mililitros en una rejilla y dos botellas de HBSS y HBSS en la campana extractora. A continuación, pipetee 25 mililitros de HBSS en el tubo debidamente etiquetado.

A continuación, coloque los pañales superpuestos en la campana extractora. Luego, saque el término placenta del recipiente y colóquelo en la campana extractora. Coloque la placenta en la almohadilla del pañal con el lado materno hacia arriba.

Si la placenta está boca abajo, use un pañal adicional para voltear la placenta. Busque el punto de ruptura de la membrana y haga incisiones con tijeras y pinzas para permitir que la membrana se despliegue y quede plana sobre la superficie de la campana extractora. Luego, use un raspador de células para raspar suavemente el tejido decidual del corion.

Transfiera el tejido a un tubo de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de HBSS Recuerde también recolectar pequeños coágulos de sangre, ya que estos también contienen algunas células deciduales. Agite suavemente el tubo de 50 mililitros para lavar el tejido recolectado, luego pase el pañuelo a través de un tamiz de metal de 250 micrómetros. Repita el proceso de lavado dos veces con HBSS, seguido de dos lavados con HBSS en tubos nuevos.

La contaminación del corion es fácilmente visible debido a su forma filiforme y color más claro y se puede eliminar después del lavado. Después del lavado, coloque el tejido en un tubo estéril de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de solución de digestión enzimática para digerir toda la decidua obtenida de toda la membrana fetal a término. Use una película de parafina para sellar la tapa del tubo.

A continuación, incubar el tubo a 37 grados centígrados en un baño de agua agitado. Configura el temporizador en 20 minutos. Una vez finalizada la incubación, retira la película de parafina.

Utilice etanol al 70% para esterilizar la superficie del tubo que contiene el tejido digerido y colóquelo debajo de la campana extractora. Agite el tubo brevemente. A continuación, pase la suspensión celular a través de un tamiz metálico a un nuevo recipiente de muestras estériles.

Diluya la suspensión celular con un volumen igual de medio de cultivo para detener la reacción enzimática. Transfiera la suspensión de la celda a un nuevo tubo de 50 mililitros. A continuación, centrifugar las células a 420 g durante 11 minutos a cuatro grados centígrados.

Si es necesario, coloque el tejido no digerido restante en un nuevo tubo de 50 mililitros que contenga 20 mililitros de solución de digestión enzimática fresca y repita el proceso de digestión. Si la digestión se realiza por segunda vez, deje el primer tubo con la suspensión celular en hielo. Una vez completada la segunda digestión, combine ambas suspensiones celulares.

Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante. Es posible que se requiera una pipeta manual para eliminar el sobrenadante. Luego, vuelva a suspender el pellet de celda en el tampón de lavado.

Después de lavar las células, repita el proceso de centrifugación. Al final del proceso de centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de tampón de lavado y 35 mililitros de tampón de lisis eritrocitaria. Para lisar los glóbulos rojos, agite brevemente el tubo al principio y al final de la incubación.

A continuación, incuba la suspensión celular en hielo durante 20 minutos. Después de la incubación, repita el proceso de centrifugación. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 40 mililitros de tampón de lavado, luego pase las células a través de un filtro de nailon de 70 micrómetros para excluir los grumos de celdas.

Repita el proceso de centrifugación. Aspire el sobrenadante una vez finalizada la centrifugación. A continuación, vuelva a suspender el pellet de células en 10 mililitros de medio de cultivo.

Cuente el número de células con un hemocitómetro utilizando el método de exclusión del colorante azul de tripán. Con el fin de determinar la composición del tipo de célula de la población de células deciduales, se ha desarrollado una estrategia de citación de flujo de imágenes multicolor. El análisis muestra la exclusión de dobletes de celdas y desechos de celdas utilizando compuertas en serie.

Una vez que se obtiene una población de células individuales libres de residuos, se determina la viabilidad de la célula utilizando un tinte de viabilidad fijable. El análisis demuestra un 80% de viabilidad de la población total de células deciduales, indicada por la compuerta azul. A continuación, las células deciduales aisladas se tiñen con anticuerpos monoclonales de ratón conjugados con fluoróforos.

Se trata de analizar la presencia de marcadores de células estromales, inmunes, epiteliales y trofoblásticas y el colorante de viabilidad. Estos marcadores determinarán los tipos de celdas deciduales. Las imágenes fluorescentes de citometría de flujo muestran una célula teñida positivamente para los cuatro marcadores y el colorante de viabilidad.

Estos marcadores se utilizan para determinar el porcentaje de cada tipo de célula en la población de células deciduales. Curiosamente, las células estromales positivas para Vimentina constituyen la mayor población de células, mientras que prácticamente no hay células trofoblásticas. Estos resultados demuestran la pureza y la alta viabilidad de las células deciduales humanas primarias aisladas.

Aquí, los diagramas de puntos obtenidos muestran la compuerta para las poblaciones de tipo de células positivas. Los controles fluorescentes menos uno se utilizan para controlar con precisión las verdaderas poblaciones de células deciduales positivas. A continuación, se utilizan imágenes de microscopía confocal de disco giratorio capturadas para validar los resultados de la citometría de flujo, mostrando que la población de células deciduales está compuesta principalmente por células estromales positivas para Vimentina sin contaminación de células trofoblásticas.

Una vez dominada, esta técnica se puede completar en tres horas. Después de este procedimiento, las células deciduales se pueden analizar de varias maneras para examinar la expresión de genes y proteínas, lo que puede ayudarnos a comprender mejor los cambios celulares que ocurren en las complicaciones del embarazo.